eIF2α激酶和eIF2α磷酸化对特异的蛋白质合成的激活作用研究进展

eIF2是一种通用的真核翻译因子,它的α亚基在eIF2激酶作用下发生磷酸化修饰后,会引起翻译受阻,从而抑制蛋白质生物合成,近年来,在酵母和哺乳动物中观察到eIF2α磷酸化后,还能特异性激活某种蛋白质的合成,如酵母的GCN4蛋白,哺乳动物的ATF4蛋白。eIF2α磷酸化修饰后具备的特异性蛋白质合成激活作用的机制及其生物学意义,备受人们关注。     

古菌蛋白激酶的研究进展

磷酸化是蛋白质翻译后修饰(post-translational modification)的主要方式,可由蛋白激酶、磷酸转移酶、磷酸化酶等多种方式催化进行。其中,由蛋白激酶(protein kinases)/磷酸酶(protein phosphatases)介导的可逆的蛋白磷酸化是细胞中信号转导的重要机制,在DNA复制、转录、蛋白质翻译、DNA损伤修复等生命过程中起广泛的调节作用。目前,古菌中蛋白激酶的研究尚属于初期阶段。虽然磷酸化蛋白质组学研究表明,古菌中存在大量的磷酸化蛋白质,但是我们对其具体催化作用的酶及调控机制尚不清楚。本文总结了古菌中已报道的蛋白激酶所参与的生命过程,包括古菌的DNA代谢、细胞代谢、细胞周期和运动机制等四个方面,并对今后的研究提出展望。     

蛋白激酶C的激活转位和它介导的信号通路

蛋白激酶Ｃ是一系列丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族,已发现了至少十二种同功酶。在静止细胞中,它主要以非活化形式存在于胞浆中,由受体－Ｇ蛋白耦联的ＰＬＣβ激活便裂细胞膜上的磷脂而释放ＤＡＧ;与ＰＫＣ的结合引起了ＰＫＣ的别构激活;而通过其它信号途径激活的ＰＬＤ水解胞膜的磷脂酰胆碱（ＰＣ）产生的磷脂酸经磷脂酸酯酶产生的ＤＡＧ可能是ＰＫＣ持续激活的必要条件。在体外实验中,ＰＫＣ的持续激活是一些细胞分化所必须的。蛋白激酶Ｃ的激活首先引起了它转位到膜,有时转位到核,并在转位后继续保持磷酸化活性,同时对它的下游底物进行磷酸化导致它们的活化。ＰＫＣ可活化ＲａｆＳｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶及ＮＦ－ｋＢ,介导细胞对外界的反应,包括对核基因表达的调节,引起细胞生长或分化等。由于Ｒａｆ可与活化的Ｒａｓ—ＧＴＰ结合从而定位到胞膜,说明蛋白激酶Ｃ与Ｒａｓ介导的Ｒａｆ－１／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ信号通路间存在着“对话”。     

蛋白激酶与神经系统功能调控

翻译后的磷酸化修饰是蛋白质结构和功能的重要调节方式。催化蛋白质磷酸化过程的蛋白激酶广泛参与神经发育、感觉、学习记忆、情绪与认知等生理过程及神经退行性疾病、慢性疼痛及精神疾病等病理生理过程,是生命科学领域的研究热点。现将举例说明蛋白激酶在神经系统内的重要作用,并介绍以蛋白激酶为靶点的药物开发现况。     

大豆下胚轴可溶性蛋白中钙激活的蛋白激酶

大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍ ａｘ Ｌ．） 下胚轴可溶性蛋白提取液进行自磷酸化,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其标记产物时发现,当有较高浓度的Ｃａ２＋ 存在于反应液中时,有一条１８ ｋＤ蛋白带被高强度标记,同时也可观察到另一条标记强度不高的６７ ｋＤ蛋白带． 当反应时间延长到１５ 或３０ｍ ｉｎ 时,它们的标记强度都逐渐减弱,最终从放射自显影底片上消失;在反应液中加入钙螯合剂ＥＧＴＡ 时,则只有６７ ｋＤ 被高强度标记;在磷酸化反应过程中加入非标记ＡＴＰ,蛋白中的３２Ｐ逐渐被非标记磷取代,表明反应体系处于磷酸化－脱磷酸化的平衡过程中,并有结果显示这一过程是钙依赖性的． 组蛋白Ｈ１ 可以使反应进程加快,表明提取液中的蛋白激酶可以利用它作为底物． 综合结果表明,１８ ｋＤ和６７ ｋＤ蛋白可能是具有自磷酸化能力且对Ｃａ２＋ 敏感的蛋白激酶,它们对Ｃａ２＋ 的不同反应,使得钙信号的传递更具可控性     

蛋白激酶对细胞的正常生长分化及恶性转化的调控

蛋白质转录后的磷酸化/去磷酸化可逆修饰,是调节控制蛋白质的酶学活性或生物学功能的重要途径。使蛋白质磷酸化的酶称为磷酸基转移酶或蛋白激酶。首先发现的是糖元磷酸化酶。目前已知用磷酸化/去磷酸化方式调节酶活性的酶类达三十多个。蛋白激酶还能催化许多非酶蛋白的磷酸化。多数蛋白激酶的活性是通过与相应特异的调节因子相互作用控制的。这些特异的调节因子常是细胞外信号的接续信使。据此可将蛋白激酶分为如下几类: 1.依赖cAMP的;2.依赖cGMP的;3.     

Anisomycin过度激活丝裂原活化蛋白激酶使tau发生过度磷酸化

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理特征之一是神经元内存在神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs),后者是由过度磷酸化的微管相关蛋白tau形成的双股螺旋细丝(paired helical filaments,PHFs)构成.为了探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在微管相关蛋白tau磷酸化中的作用及机制,本实验用0.1 μg/mL、0.2 μg/mL和0.4μg/mL三种不同浓度的MAPK激动剂anisomycin处理小鼠成神经瘤细胞株(mouse neuroblastoma cells,N2a),检测MAPK活性的变化及其与tau蛋白多个AD相关位点过度磷酸化的关系,并检测糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性变化.结果显示,anisomycin以剂量依赖的方式激活MAPK活性,但免疫印迹结果显示tau蛋白的Ser-198/199/202位点和Ser-396/404位点的过度磷酸化只在anisomycin浓度为0.4 μg/mL时出现,三种浓度的anisomycin均未引起tau蛋白Ser-214位点磷酸化的改变;同时,GSK-3活性在anisomycin为0.1 μg/mL时没有明显变化,当anisomycin浓度升高到0.2 μg/mL和0.4 μg/mL时出现明显增高,而PKA的活性没有明显的改变.使用GSK-3的特异性抑制剂氯化锂(LiCl)则完全阻断MAPK被过度激活导致的tau蛋白磷酸化水平的增高,而同时MAPK活性不受影响.以上结果提示:过度激活MAPK可以导致tau蛋白Ser-198/199/202和Ser-396/404位点过度磷酸化,其机制可能涉及MAPK激活GSK-3的间接作用.     

蛋白激酶与植物逆境信号传递途径

蛋白质的可逆磷酸化是细胞信号识别与转导的重要环节,蛋白激酶主要催化蛋白质的磷酸化作用,植物中已发现并分离了大量蛋白激酶及其基因,它们介导了植物激素和胞外环境信号等引起的多种生理生化反应。文章着重介绍分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（CDPK）、受体蛋白激酶（RPK）、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等多种蛋白激酶在植物逆境信号识别与转导中的作用。     

细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞蛋白质磷酸化作用的影响

用液体闪烁计数法研究了细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞质蛋白质磷酸化的作用。结果表明：烟草细胞细胞质蛋白质磷酸化活性在细胞培养过程中逐渐增加,达到最高峰后又开始下降。在细胞质蛋白质磷酸化强度高峰时,加入抗CaM血清后,细胞质蛋白质磷酸化活性受到了部分抑制。加抗CaM血清后再补加CaM能够部分解除抗CaM血清对细胞质部分与细胞核部分蛋白质磷酸化的抑制作用。外加纯化钙调素可以引起烟草悬浮培养细胞细胞质蛋白质磷酸化的活性增强,并且这种增强作用具有时间（高峰为70min）与剂量（最适为CaM10^-7mmol/L）依赖性。CaM引起的细胞质蛋白质磷酸化变化与红光所引起的细胞质蛋白质磷酸化变化在时间进程上是不相同的。     

细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞蛋白质磷酸化作用的影响

用液体闪烁计数法研究了细胞外钙调素对烟草悬浮培养细胞质蛋白质磷酸化的作用。结果表明烟草细胞细胞质蛋白质磷酸化活性在细胞培养过程中逐渐增加,达到最高峰后又开始下降。在细胞质蛋白质磷酸化强度高峰时,加入抗CaM血清后,细胞质蛋白质磷酸化活性受到了部分抑制。加抗CaM血清后再补加CaM能够部分解除抗CaM血清对细胞质部分与细胞核部分蛋白质磷酸化的抑制作用。外加纯化钙调素可以引起烟草悬浮培养细胞细胞质蛋白质磷酸化的活性增强,并且这种增强作用具有时间（高峰为70min）与剂量（最适为CaM10-7mmol/L）依赖性。CaM引起的细胞质蛋白质磷酸化变化与红光所引起的细胞质蛋白质磷酸化变化在时间进程上是不相同的。     

酪氨酸专一的蛋白激酶

80年代以来发现某些癌基因的蛋白产物和某些生长因子的受体具有一种特殊的蛋白激酶——酪氨酸专一的蛋白激酶的活性,它所催化的蛋白质分子中特定的酪氨酸残基的磷酸化作用仅占整个细胞中蛋白质磷酸化的0.05%。两种来源的酪氨酸蛋白激酶在分子结构和酶的性质方面都有不少相似之处。虽然它们的生理底物尚未得到鉴定,但根据已有的实验证据,它们与细胞的生长调控及癌变可能有密切的关系。     

α1-肾上腺素受体激活大鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶

为了验证心脏腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是否为肾上腺素受体（adrenergic receptor,AR）的下游信号分子,本实验在大鼠心室肌源细胞和大鼠心脏中观察了α-AR对AMPK的激活作用,利用Western blot检测了AMPK-α总蛋白表达量及其172位苏氨酸磷酸化水平。雄性Sprague-Dawley大鼠皮下植入去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）,苯肾上腺素（phenylephrine,PE）或者溶剂载体[0．01％（W／V）维生素C]的缓释微泵（osmotic minipump）。NE或PE以每小时0．2 mg／kg的速率持续输注,7 d后用AMPK-α抗体免疫沉淀处理样本并测定AMPK的活性。结果显示,在细胞水平,NE引起的AMPK磷酸化水平增高具有时间依赖和剂量依赖特点, NE处理细胞10 min后AMPK磷酸化水平达到最高峰;NE引起的这种效应对β-AR的拮抗剂普萘洛尔（propranolol）不敏感,但是可以被α1-AR拮抗剂哌唑嗪（prazosin）所阻断。结果提示,α1-AR介导AMPK的磷酸化,但β-AR无此作用。AR激动剂持续灌注7 d后,AMPK的活性在NE（7．4倍）和PE（6．0倍）灌注组较对照组显著增高（P〈0．05,H=6）。PE持续灌注组大鼠与对照组相比无明显的心肌肥厚和组织纤维化变化。本文证明α1-AR激动剂可以增强AMPK的活性,揭示了心脏中α1-AR激动在调控AMPK活性方面的重要作用。深入了解α1-AR介导的AMPK激活可能在心衰治疗中具有重要的临床意义。     

植物抗逆相关蛋白激酶的结构与功能

植物在遭受外界逆境胁迫时,体内的信号传导系统能够感知、传递逆境胁迫信号,并引起各种生理生化反应以适应环境。植物蛋白激酶在信号感知、传导以及基因的表达调控中起重要的作用。蛋白激酶在信号传导过程的功能是磷酸化修饰目的蛋白,而磷酸化的实现需要蛋白质之间相互作用。本文从植物蛋白激酶的结构、分类、与激素信号传导之间的关系等方面进行了系统的阐述,对蛋白激酶介导的植物抗性与发育的最新研究进展进行了系统的总结,为解析蛋白激酶在植物生长发育中的抗逆机理提供依据。     

促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的研究进展

MAPK信号传导通路在真核生物细胞的生化和分化、细胞周期调节和细胞凋亡过程中发挥着重要的作用。生物化学研究和分子生物学鉴定表明：在酵母和哺乳动物细胞中MAPK信号传导通路都有一个保守的三组分激活模件,该模件内的激酶引发了一系列的磷酸化级联反应。了解MAPK信号传导通路的组成部分、调控方式和作用机制,有助于对因信号传导通路的调节失控而引起的疾病进行预防和治疗。     

鉴定人甲基化CpG结合结构域蛋白4为蛋白激酶X的底物

人蛋白激酶X(PrKX)是由X染色体编码的一种cAMP依赖性蛋白激酶,但是到目前为止已鉴定到的PrKX底物还很少.为了鉴定蛋白激酶X的底物,我们以蛋白激酶X为诱饵进行了酵母双杂交实验,结果发现甲基化CpG结合结构域蛋白4(MBD4)与PrKX在酵母细胞内相互作用较强.GST融合蛋白沉降和细胞内蛋白质的免疫共沉淀证实PrKX与MBD4之间确实存在相互作用.进一步研究表明,大肠杆菌中表达的重组MBD4在体外可以被PrKX磷酸化,而且MBD4蛋白的磷酸化能明显增强它在体外与甲基化DNA探针的结合活性.     

玉米早期花药蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析

蛋白质磷酸化修饰是调控其功能的一种重要方式。植物有性生殖过程在农作物产量形成和物种繁衍过程中起着重要作用。作为植物雄性生殖器官的花药,其正常生长发育对于保证形成功能性配子(花粉)以及完成双受精过程至关重要。本研究以重要农作物玉米(B73)为材料,利用Nano UHPLC-MS/MS质谱技术对玉米早期发育的花药在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平进行全面分析,以探究玉米花药发育过程中的蛋白调控网络和磷酸化修饰调控网络。在蛋白质组学分析中,共鉴定到了3 016个多肽,匹配到1 032个蛋白质上。通过Map Man分析,预测到了一些和花药发育相关的蛋白质,例如受体激酶(GRMZM2G082823_P01、GRMZM5G805485_P01等)。另外,在磷酸化蛋白质组学研究中,通过对Ti O2亲和层析富集到的磷酸化多肽进行质谱分析,检测到了257个磷酸化多肽,匹配到210个蛋白质上。我们的数据揭示了玉米花药发育过程中的223个磷酸化位点。与已发现的玉米中的86个磷酸化蛋白质(植物蛋白磷酸化数据库(P3DB):http://www.p3db.org/organism.php)相比,其中203个磷酸化蛋白和218个磷酸化位点为首次揭示。进一步生物信息学分析表明:磷酸化在14-3-3蛋白质、激酶、磷酸酶、转录因子、细胞周期和染色质结构相关的蛋白质介导的玉米早期花药发育过程中起着重要的调控作用。总之,本研究首次在蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学水平研究了玉米早期花药发育的蛋白质调控网络,不仅丰富了玉米蛋白质和磷酸化修饰蛋白质数据库,并为利用遗传学和生物化学手段深入研究玉米花药发育的分子调控机理提供了基础。     

蛋白激酶C在血小板聚集中的作用

利用￣（３２）Ｐ－ＮａＨ２ＰＯ４标记猪血小板,以蛋白激酶Ｃ的４０ｋＤ底物为蛋白激活的标志．用血小板激动剂在聚集浓度范围内处理血小板,结果表明,除了不能使猪血小板聚集的肾上腺素外,凝血酶等激动剂都使血小板４０ｋＤ底物蛋白磷酸化明显增加,同时３８ｋＤ,２６ｋＤ蛋白质磷酸化也明显增加,且４０ｋＤ底物磷酸化与血小板聚集有平行增加关系．蛋白激酶Ｃ在血小板聚集中可能起着重要的调节作用。     

LPS和PMA诱导小鼠腹腔巨噬细胞的PKC-α和PKC-ε的激活与转位

利用免疫印迹技术及内源性底物磷酸化方法,我们研究了在巨噬细胞的信号传递中起重要作用的PKC同功酶的分布及其在免疫调变剂LPS的刺激下产生的激活和转位。在未激活的巨噬细胞中,PKC-β的含量高于PKC-α和ε,它和PKC-α的分布均是胞质中大于胞膜。以PMA为阳性对照,结果提示LPS介导的抑制性巨噬细胞兔疫调变机制中涉及到了PKC-α和PKC-ε从胞质到膜组份的转让而不是PKC-β(PKC-βⅠ或βⅡ)的转位。应用PKC-依赖的内源性底物磷酸化的分析,结果说明胞质中55 kDa和74 kDa蛋白质磷酸化条带的减弱和膜组份中的类似蛋白质(PMA与LPS的刺激有不同的反应)磷酸化强度的增加,与PKC的转位有着相同的时间梯度。这结果提示在LPS介导的免疫调变信号传递通路中,PKC-α和PKC-ε可能介导了信号的传导及放大。     

磷酸化蛋白质组学的新进展及其在肝脏生理和病理机制中的应用

蛋白质磷酸化是最常见的蛋白质翻译后修饰形式。由于蛋白质的磷酸化形式可以被磷酸酶和磷酸激酶进行可逆的调控,所以在众多的生命活动过程中蛋白质的磷酸化修饰起着重要的调控作用,因此对生物体内蛋白质磷酸化修饰的系统研究对于揭示生命科学的奥秘显得十分重要。近年来,随着质谱技术和生物信息学软件以及磷酸化肽段富集方法的发展,利用质谱对生物体内蛋白质磷酸化修饰研究的技术逐渐成熟。肝脏作为人体最重要的代谢和免疫器官,深入研究肝脏细胞内蛋白质磷酸化修饰形式对于理解其功能具有重要指导意义。目前,迅速发展的磷酸化蛋白质组学技术已经被广泛应用到肝脏功能的生物学研究中。这些研究加深了人们对肝脏的生理及病理状态的分子生物学机制的了解。本文综述了当前磷酸化蛋白质组学的研究进展和磷酸化蛋白质组学在肝脏中的研究。     

蛋白激酶C在血小反聚集中的作用

利用＾３２Ｐ－ＮａＨ２ＰＯ４标记猪血小板,以蛋白激酶Ｃ的４０ｋＤ底物为蛋白激活的标志。用血小板激动剂在聚集浓度范围内处理血小板,结果表明,除了不能使猪血小板聚集的肾上腺素外,凝血酶等激动剂都使血小板４０ｋＤ底物蛋白磷酸化明显增加,同时３８ｋＤ,２６ｋＤ蛋白质磷酸化也明显增加,且４０ｋＤ底物磷酸化与血小板聚集有平行增加关系。