鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特 的关键作用,因而也称为微囊藻毒素去毒酶. 从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列. 序列分析结果表明,鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920 bp,其中5′-UTR长74 bp,3′-UTR长174 bp,编码区长672 bp,编码223个氨基酸. 应用基因组步行法,在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878 bp序列. 与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同,鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区,发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE),表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.     

淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因的克隆

微囊藻毒素去毒酶在鱼类微囊藻毒素去毒过程中起着关键作用,研究成功克隆鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心片段而首次获得这些淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶氨基酸序列。鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼微囊藻毒素去毒酶基因与人、小鼠、大鼠、牛、猪、羊的谷胱甘肽S-转移酶基因氨基酸同源性为60%左右,表明淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因在进化上变异性较大,与其承担微囊藻毒素去毒代谢之特殊功能相适应。     

鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特的关键作用,因而也称为微囊藻毒素去毒酶.从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列.序列分析结果表明,鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920bp,其中5′-UTR长74bp,3′-UTR长174bp,编码区长672bp,编码223个氨基酸.应用基因组步行法,在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878bp序列.与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同,鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区,发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE),表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.     

阿氏浮丝藻mcyT基因序列多样性研究

为研究我国浮丝藻（Planktothrix Anagnostidis et Komrek）的毒素相关基因,选取分离自我国不同省份水体的13株阿氏浮丝藻,通过PCR检测其微囊藻毒素合成酶基因mcyA、mcyE及mcyT研究其毒素基因特性。PCR结果表明除mcyT之外其他引物检测均无扩增产物,说明这13株浮丝藻不具备产微囊藻毒素的能力。通过克隆测序得到mcyT序列,并进行分子系统分析,构建了关于mcyT序列的Neighbor-Joining系统树,结果表明mcyT序列可以将产毒与不产毒浮丝藻分为两大独立的分支,两个分支之间的最低序列相似度分别为98.5%和99.1%。研究结果可为后续研究我国浮丝藻的微囊藻毒素合成相关基因的多样性以及分子监测提供参考。       

利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节分布特点

为研究景观水体中产毒微囊藻的季节性分布特点,利用针对蓝藻和微囊藻的16srDNA、微囊藻毒素合成酶 mcyB 基因的部分核苷酸序列设计和筛选的特异性引物,对广州市内8个景观湖108份水样进行了冬季、夏季和秋季的二重及套式PCR的检测。结果显示,在冬季能被检测出的产毒微囊藻的阳性水样为42份,夏季为102份,而秋季为100份;阳性率分别为38.9%、94.4%、92.5%,产毒微囊藻在夏季和秋季阳性率高。结果表明在冬季、夏季和秋季均有产毒微囊藻分布;夏、秋季是广州市景观水体微囊藻污染的高峰季节,值得引起水文部门足够的重视。     

采用套式PCR检测水库产毒微囊藻

根据所测定的微囊藻毒素合成酶mcyB基因的部分核苷酸序列,设计并筛选出两对特异性引物,用于产毒微囊藻的套式PCR检测。套式PCR针对毒素基因的检测结果与ELISA针对微囊藻毒素的检测结果相一致,但灵敏度更高。套式PCR的检测下限达1—10个微囊藻细胞/反应。采用套式PCR对广东12个主要供水水库的247份水样进行了产毒微囊藻检测,共检出阳性水样82份,阳性率为33.2%。这些阳性水样分布于除深圳水库以外的其他11个水库;其中汤溪水库水样套式PCR检出阳性率最高,达67.4%,其水样一步PCR的检出阳性率亦达25.6%,值得引起水文部门重视,并进行进一步跟踪监测。     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

全细胞多重PCR检测蓝藻、微囊藻及产毒微囊藻方法初探

选取三对分别针对微囊藻、蓝藻16S rDNA及微囊藻毒素合成酶基因mcyB的保守序列的特异性引物209F/409R、27F1/409R、MTR/MTF,其中409R为一条共用引物。设计并优化了一种可以同时检测蓝藻和微囊藻的两重全细胞PCR方法和一种可以同时检测蓝藻、微囊藻和可产毒微囊藻的三重全细胞PCR方法,并且测试了这两种PCR反应的灵敏度区间,分别为10⁵～10³cell·mL^-1、10⁵～10²cell·mL^-1。对采集水库水样检测结果表明双重全细胞PCR方法可以直接应用于对天然水样的检测,三重全细胞PCR方法可用于实验室培养藻细胞的筛查。全细胞多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,在水体微囊藻毒素检测预警方面具有应用价值。     

几株球形芽孢杆菌二元毒素基因的检测及对敏感和抗性尖音库蚊的毒性

根据Bacillus sphaericus 2362二元毒素基因核苷酸序列合成的一组寡聚核苷酸为引物,通过PCR扩增出1.1 kb的DNA片段作探针检测了C₃-41、IAB881、IAB872、BS-197和lPl-G菌株中二元毒素基因。Southern杂交表明C₃-41、IAB881、IAB872和BS-197菌株中3.5kb Hind III及LPl-G中4.7kb Hind III的酶切片段分别带有与探针有高度同源性的二元毒素基因。SDS-PAGE和Western印迹杂交表明所有菌株都能产生41.9kD和51.4kD的毒素蛋白。C₃.41、IAB881、BS.197和2362的全发酵液和碱抽提液对敏感尖音库蚊Culex pipienssubsp.Pipiens幼虫毒性高,但对抗性幼虫几乎无毒,LPl-G对敏感和抗性蚊幼虫具有相同的中度毒杀作用;IAB872对敏感幼虫毒性高,对抗性幼虫的毒力同LPl-G相似。这两株菌对抗性蚊幼虫的毒性可能是由Mtx毒素蛋白所导致的。     

一株微囊藻毒素降解辅助菌的分离和鉴定

以从太湖蓝藻中提取的微囊藻毒素作为微囊藻毒素降解菌的筛选物质, 通过稀释平板涂布法从腐烂的蓝藻中富集分离到一菌株, 经形态特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析将该菌株(GenBank 序列登录号为GQ143751)鉴定为藤黄微球菌(Micrococcus luteus); 微囊藻毒素降解实验结果表明该菌株几乎不能降解微囊藻毒素, 但可以明显促进一株微囊藻毒素降解菌微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)对微囊藻毒素的降解能力, 将筛选菌株与微嗜酸寡养单胞菌混合培养, 混合菌对微囊藻毒素的降解能力比微嗜酸寡养单胞菌单独培养时提高66.7%。     

甲基对硫磷降解菌L1的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

从农药厂的污水处理池中分离到一株能高效降解甲基对硫磷的菌株L1,L1能以甲基对硫磷为惟一碳源、氮源和能源生长;经生理生化实验和16s rRNA同源性分析,初步将L1归为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。紫外分光光度法对L1的降解性能研究表明,L1能在12h内将50mg/L的甲基对硫磷完全降解;用PCR方法克隆其甲基对硫磷降解酶基因mpd,这是迄今首次从革兰氏阳性菌中克隆到的mpd基因。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

利用3对引物鉴定产毒和非产毒微囊藻

根据微囊藻毒素合成酶基因簇序列 ,合成了 3对引物epF/mb1R ,mcF/teR ,mcF/umR ,通过全细胞PCR的方法检测了 19种不同来源微囊藻产毒的情况。 3种引物对 15株产毒微囊藻中均可扩增到预期大小的片段 ,测序结果证明这些片段是微囊藻毒素合成酶基因片段。PCR反应结果与HPLC分析所得到的结果有良好的对应性。在此基础上 ,初步确定了 3对引物检测产毒微囊藻对细胞浓度要求的下限。与其它引物相比 ,3对引物的特异性强 ,扩增条带大小适中 ,便于观察     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT-PCR和PCR-RACE技术,从菊科植物甘菊(Dendranthema lavandulifolium)中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。DlBADH1的cDNA全长1821 bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918 bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97%,推导的氨基酸序列的同源性为98%。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64%以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT-PCR-Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。     

罗非鱼微囊藻毒素去毒相关基因克隆与活体表达研究

可溶性谷胱甘肽S-转移酶(Soluble glutathione S-transferase,sGST)催化微囊藻毒素(Microcystins,MCs)与还原型谷胱甘肽(GSH)的加合去毒代谢过程,谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)为sGST的去毒反应提供GSH,解偶联蛋白2(Uncoupling protein 2,UCP2)则可抑制微囊藻毒素诱发活性氧导致的肝细胞凋亡。本研究从罗非鱼肝脏通过简并引物克隆sGST、GPX与UCP2基因cDNA核心序列,并应用5’RACE和3’RACE技术分别扩增罗非鱼肝脏sGST基因cDNA序列5’末端和3’末端序列而获得其cDNA全序列。罗非鱼肝脏sGST基因cDNA全序列长861 bp,其中5’非翻译区(5-’UTR)为25 bp,3’非翻译区(3-’UTR)为167 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码222个氨基酸,包含脊椎动物完整sGST的2个功能域:N-末端功能域(GSH结合位点)和C-末端功能域(底物结合位点)。罗非鱼sGST与真鲷、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、斑马鱼同源性较高,达到64.3%—78.5%,而与人、大鼠、小鼠、牛、猪、鸡差异较大,氨基酸同源性为48.2%—55.9%。罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因cDNA核心序列长280 bp、776 bp,分别编码92、258个氨基酸。罗非鱼GPX与条石鲷、虹鳟、斑马鱼、人、大鼠、小鼠、牛、猪GPX同源性均较高,达到69.6%—85.9%。罗非鱼UCP2与真鲷、斑马鱼、鲤鱼、欧洲白鲑(Leuciscus cephalus)、草鱼、人、大鼠、小鼠UCP2同源性更高,达到71.8%—93.8%。通过对罗非鱼(5—8 g)活体腹腔注射亚致死量MC-LR(50μg/kg bwt),发现微囊藻毒素对罗非鱼肝脏sGST基因表达有显著的诱导作用(p<0.05),注射微囊藻毒素24h后sGST基因mRNA表达水平上调80%。注射微囊藻毒素24h后,虽然罗非鱼肝脏GPX与UCP2基因mRNA表达水平亦出现明显的升高趋势,但两者均未出现显著性的变化(p>0.05)。本研究从基因表达调控的角度证实,罗非鱼肝脏sGST在微囊藻毒素去毒过程中可能发挥关键作用,同时也说明罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因可能在微囊藻去毒过程中发挥协同作用。     

利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因

目的：新型琼胶酶基因的筛选。方法：根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a（＋）载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果：获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U.ml-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论：采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。     

菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为横板．经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR)。扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pucl9转化至E．Coli DH5a菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99．8％．氨基酸序列同源性达99．6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体．     

香蕉束顶病毒复制酶基因克隆及转基因表达

以广州市郊获得的香蕉束项病毒(BBTV)的DNA为模板,进行PCR扩增得到香蕉束项病毒复制酶基因的1.1 kb DNA.所获得的DNA序列与澳大利亚的BBTV序列的同源性达90%,这部分序列编码香蕉束顶病毒复制酶基因的羧基端.将改造的BBTV复制酶基因克隆到pBll21的CaMV 35S和NOS终止序列之间,构建表达载体,并采用基因枪轰击香蕉试管苗生长点组织的方法,经PCR检测和Westem blot分析,获得4株具有BBTV复制酶基因整合表达的To代转基因香蕉.转基因植株的抗病性正在检测之中.     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建

根据已克隆的鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)微囊藻毒素去毒酶cDNA全序列设计特异引物,利用PCR方法获得鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因编码区,将该编码区与绿色荧光蛋白连接,分别构建融合表达载体pEGFP-N1-sGST和双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST。利用脂质体转染法将融合表达载体pEGFP-N1-sGST转染Hela细胞,60h后检测到绿色荧光基因表达;通过显微注射,将双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST注入斑马鱼(Daniorerio)受精卵,获得了转鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因斑马鱼,从而构建了微囊藻毒素去毒酶转基因模型。上述2种转基因模型的成功构建为进一步研究鲢鱼、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、罗非鱼(Oreochromisnilotica)等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因调控元件、去毒分子机理及研发转基因鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等微囊藻毒素高效生物去毒器奠定了基础。