一株产黄纤维单胞菌的选育及产酶特性研究

从土壤中筛选分离出的产纤维素酶菌株S26(经中国科学院微生物所鉴定为产黄纤维单胞菌Cellulomonas flavigena),测定酶活为 25.86 U/mL,以此为出发菌株,经UV反复诱变处理,多代选育,筛选出1株纤维素酶高产突变株UY-4,酶活力达 87.92 U/mL,是出发菌株的 3.4 倍,而且遗传性能稳定.对UY-4产酶影响因素的研究表明,产酶最适条件为稻草与麦麸32、接种量10%(体积与质量比), (NH4)2SO4 0.5%、起始pH 7.4、35 ℃、培养 72～84 h.     

二株高活力纤维素分解菌EA3-867和N2-78的获得及其特性的比较

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rifai)野生型菌株AS 3．3002和木3,分别经多种物理化学因素(高能电子、60钴、紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯等)诱变处理后,得到二株变异菌株EA3,-867和N2-78。它仉的固体曲、液体曲和酶制剂的各项纤维紊酶活力测定结果,均比野生型菌株明显提高。N2-78菌株经摇瓶培养60小时,其CMC糖化力为255毫克葡萄糖／毫升酶液,滤纸糖化力为8．2毫克葡萄糖／毫升酶液,棉花糖化力为13．4毫克葡萄糖／毫升酶液,分别比野生型菌株提高H．6倍、5．3倍和7倍。由EA3-867和N2-78的固体曲制取的纤维素酶粗制剂,其各项纤维紊酶话力测定结果,均较Onozuka R-10纤维索酶制剂为高。上述野生型菌株及变异菌株均具有果胶酶、半纤维紊酶、淀粉酶和少置蛋白酶的活力。变异菌株中果胶酶的活力较野生型菌株为高,淀粉酶和蛋白酶活力则较低。同时,变异菌株的形态也与原始菌株有明显差异。上述四株菌的孢子致死温度相同,CMC糖化、滤纸崩溃和滤纸糖化的最适pH相近,最适温度相同,分别为pH 4.4、60℃,pH4.8、60℃和pH4.8、60℃。     

亚硝基胍诱变选育低温β-半乳糖苷酶高产菌

以野生低温β-半乳糖苷酶产生菌水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)14-1为出发菌株.通过亚硝基胍(NTG)诱变及低温驯化,采用选择性平板初筛和摇瓶复筛,筛选出一株产酶活力比原始菌株提高54%的突变株,该突变株经传5代培养,产酶特性稳定.     

产氢红杆菌类胡萝卜素突变株的诱变和筛选

用紫外线照射和氯化锂夹层平板培养法对产氢红杆菌(Rhodobacter sp.R7)进行复合诱变,分离获得了一株产氢效率提高的类胡萝卜素突变株R726.该突变株在表观特征、光谱学特征、色谱特征、生长和产氢性能等方面与出发菌株有明显不同,但16S rDNA序列一致.R726菌株有550 nm类胡萝卜素特征性吸收峰,类胡萝卜素组成上比出发菌株少一黄色类胡萝卜素组分,生长和产氢性能均高于出发菌株,产氢效率比出发菌株提高了33.3%,类胡萝卜素含量比出发株提高了53.8%.     

草果叶斑病防治初步研究

从发病的草果叶片上分离得到草果叶斑病病原菌,进行药剂筛选试验,把不同处理的哈茨木霉(Tri-choderma harzimum)菌株和病原菌对峙培养,结果表明:春雷霉素400倍药液下病菌菌丝无法生长,金歌1 500倍、多菌灵800倍、易保1000倍、春雷霉素500倍药液对病原菌菌丝生长抑制率在61%以上;不同处理的哈茨木霉菌株对草果叶斑病病原菌均有抑制效果,且药物诱变和紫外线诱变的突变菌株比野生型菌株抑菌效果显著。     

激光诱变选育高产PUFAs真菌菌株的研究

采用PIV400型Nd：YAG激光器,对少见报道的产PUFAs丝状真菌菌株Monoblepharis polymorpha Comu进行激光诱变育种。在激光照射剂量：波长532nm,功率50mW,时间10min下,孢子致死率为75％-80％。突变株中w-3系列PUFAs正突变率大于80％,w-3系列突变株FPAm59传代10代以上性能稳定,在土豆基质上摇瓶培养6d后,生物量达到8g/L,产油率53．4％,GLA343．1mg／L、从1209．0mg／L、EPA125．1mg／L、DHA119．4mg／L;分别比对照菌株提高了2．5倍、9．7倍、18．0倍、6．6倍、10．3倍、3．8倍。结果表明,激光诱变育种是获得PUFAs高产菌株尤其是生产w-3系列PUFAs菌株的有效方法。     

UV+MW复合诱变结合抗性突变筛选替考拉宁高产菌株

采用微波照射(MW)、紫外照射(UV)和MW+UV处理技术,对替考拉宁产生菌AT-92的孢子进行诱变,诱变处理的孢子悬液涂布在含替考拉宁致死浓度的培养基平板上培养,获得替考拉宁抗性突变株,通过摇瓶发酵对替考拉宁抗性基因突变株进行筛选,获得一株遗传性状稳定的替考拉宁高产菌AT 92-52-37菌株,其产替考拉宁能力比出发菌株的提高5倍。     

产氢红杆菌类胡萝卜素突变株的诱变和筛选

用紫外线照射和氯化锂夹层平板培养法对产氢红杆菌(Rhodobacter sp. R7)进行复合诱变, 分离获得了一株产氢效率提高的类胡萝卜素突变株R726。该突变株在表观特征、光谱学特征、色谱特征、生长和产氢性能等方面与出发菌株有明显不同, 但16S rDNA序列一致。R726菌株有 550 nm类胡萝卜素特征性吸收峰, 类胡萝卜素组成上比出发菌株少一黄色类胡萝卜素组分, 生长和产氢性能均高于出发菌株, 产氢效率比出发菌株提高了33.3%, 类胡萝卜素含量比出发株提高了53.8%。     

链霉素抗性突变--纳他霉素高产菌株的选育研究

应用链霉素抗性筛选法,将经过紫外线诱变处理的纳他霉素生产菌——褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATC13326的孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度(0．6μg／mL)的培养基平板上,获得了122株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有13株,产量阳性效率达到10．6％,同时获得了产抗生素能力为出发菌株1．46倍的突变株SG-56。     

以脂肪酶为指标筛选赤霉素高产菌株的研究

以藤仓赤霉菌978对978#菌丝机械断裂后,采用紫外(30W,20cm)诱变处理60s,以脂肪酶活性为初筛指标筛选得到4株产赤霉素效价比出发菌株高的突变株,其中菌株GL-2在添加3%豆油的发酵培养基中产赤霉素能力比菌株978#在全淀粉发酵培养基发酵产素能力提高了1.2倍.调整补油工艺后,菌株GL-2产素能力进一步提高到...     

枯草芽孢杆菌产胞苷的初步研究

目的:通过对野生型枯草芽孢杆菌NO122的诱变筛选,选育出胞苷产生菌株。方法:以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株进行紫外线、硫酸二乙酯诱变,经3-脱杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷结构类似物平板定向筛选产胞苷突变株;研究碳源、氮源、温度、初始pH值等发酵条件对该突变菌株产胞苷的影响。结果:经诱变传代后得到突变株TZM1012,该突变株在发酵温度37℃、初始pH7.2、摇床转速220r/min的条件下,摇瓶发酵72h,发酵液中的胞苷可达1.873g/L,并具有较好的遗传稳定性。结论:获得产胞苷生产菌株,并具有较好的遗传稳定性。     

联合固氮菌Enterobactergergoviae57—7泌铵突变株的分离和特性

经 Tn5转座子诱变从野生型菌株 ( Enterobacter gergoviae 5 7- 7)筛选到抗甲胺 ( 0 .3mol/L )的泌铵突变株 MG61 ,该突变株在固氮生长时能分泌铵 2 .0 mmol/L。由于泌铵 MG61的生长比野生型菌株慢 ,在培养基中含铵 ( 5 mmol/L或 30 mmol/L)条件下 ,MG61的生长速率与对照相同 ,而远比野生型菌株慢 ,表明 MG 61不能很好地利用铵。在含 2 0 mmol/L铵的培养基中 MG 61仍表达 86%的固氮活性 ,而野生型菌株完全丧失了固氮活性。在谷氨酸存在下 MG61的生长速率及固氮酶活性都比对照高。在硝酸盐存在下 MG61的生长速率与对照相同 ,但泌铵量达 7.8mmol/L。     

野油菜黄单胞菌NK-01编码生物合成多糖基因的克隆

采用甲基磺酸乙醇(EMS)诱变野油菜黄单胞菌NK-01得到多糖合成缺陷的不产枯突变株。经SalⅠ部分酶切得到的野生型NK-01染色体DNA片段,连接到广泛寄主载体pRK293上,在E.coli中建立完整的NK-01基因文库。通过使一株不产多糖突变株在协助质粒pRK2013存在下,分别与含基因文库的E.coli菌落群进行三亲结合转移筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体,对接合后体进行的重组质粒的酶切分析表明,所克隆的DNA具有片段的重叠部分。上述重组质粒对外9株不产多糖突变株互补检测及遗传分析的     

产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法

目的:采用亚硝基胍(NTG)诱变结合96孔板高通量筛选方法筛选产耐高温谷氨酰胺转胺酶(MTG)的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)。方法:通过优化96孔板高通量测定MTG活性的方法、确定筛选温度和时间,建立了产耐高温MTG菌株的快速筛选方法;通过优化NTG诱变条件建立了筛选突变库;通过96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了产耐高温MTG的突变株12-82,并通过摇瓶发酵对12-82所产MTG进行热稳定性分析。结果:采用2mg/ml NTG、p H8.0、60min的诱变条件获得突变株,将突变株的发酵上清液于70℃水浴7.5min,再在37℃空气浴、反应10min的条件下测定MTG活性,从5 200株突变株中筛选出5株产耐高温MTG的突变株,其中突变株12-82在50℃水浴60min以及70℃水浴1.5min的酶活残留率均比出发株高出近20%,且80℃保温2min仍有11.9%的酶活残留率。结论:利用NTG诱变结合96孔板高通量筛选的方法筛选到5株所产MTG热稳定性相对较高的突变株,其中突变株12-82在50℃、70℃和80℃的酶活残留率均有10%~20%的提高。这为高温食品加工领域所需耐高温MTG生产菌株的高效筛选提供了可行性方案。     

高通量筛选高产酪氨酸的酿酒酵母菌株

酪氨酸是重要的芳香族氨基酸,自身不仅具有重要的营养价值,也是合成香豆素类化合物和黄酮类化合物的重要前体。文中以实验室前期构建的一株解除了酪氨酸反馈抑制的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae LTH0 (ARO4K229L,ARO7G141S,Δaro10,Δzwf1,Δura3) 为出发菌株,异源表达甜菜黄素合成基因DOD和CYP76AD1,使酿酒酵母产生黄色荧光。然后利用紫外诱变和常压室温等离子体 (Atmospheric and room temperature plasma,ARTP) 诱变相结合的方法对上述菌株进行随机诱变,并通过流式细胞仪筛选荧光强度显著提高的突变株。其中突变株LTH2-5-DOD-CYP76AD1在激发波长485 nm、发射波长505 nm处荧光强度为 (5 941±435) AU/OD,比诱变前提高了8.37倍。对诱变后荧光强度提高较多的14株突变株进行发酵生产酪氨酸,胞外酪氨酸产量最高为26.8 mg/L,比出发菌株提高了3.96倍。进一步异源表达约翰逊黄杆菌Flavobacterium johnsoniae来源的酪氨酸解氨酶FjTAL,对香豆酸产量达到119.8 mg/L,比出发菌株LTH0-FjTAL提高了1.02倍。     

紫外线与亚硝酸钠复合诱变选育L-组氨酸产生菌

以1株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S_6作为出发菌株,利用亚硝酸钠(NaNO_2)、紫外线(UV)进行诱变,通过实验证明亚硝酸钠诱变时间在180 s后致死率达到80%,紫外线在照射30 s后致死率达到80%。诱变后的突变菌株经6-巯基嘌呤结构类似物的抗性平板筛选,最终筛得3株菌,Y_1产L-组氨酸量达到331 mg/L,比出发菌株S_6高了5.08%,Z_2产L-组氨酸量达到325 mg/L,比出发菌株S_6高了1.9%,F_6产L-组氨酸量达到330 mg/L,比出发菌株S_6高了7.14%。结果显示,经紫外线与亚硝酸钠复合诱变后的菌株F_6产L-组氨酸的产量最高,比亚硝酸钠诱变后的菌株产L-组氨酸量提高2.06%,比紫外线诱变后的菌株产L-组氨酸量提高5.24%。     

协同诱变法选育虾青素高产优良酵母菌株

以红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)野生型菌株GH1为研究对象,选育虾青素高产优良酵母菌株,并初步研究其生长特性。对野生型菌株GH1用紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)协同诱变,用抗霉素A筛选,选育出虾青素高产突变菌株GH1-7.1。突变菌株GH1-7.1的虾青素最高产量达1200μg/gDCW,比野生菌株GH1的虾青素最高产量271μg/gDCW高出4倍,并且生长加快,达到最高生物量和最高虾青素产量的时间比野生菌株缩短了24h;野生菌株GH1的最适生长温度为20℃,高于28℃则不生长,而突变菌株GH1-7.1的最适生长温度为28～30℃,比野生菌株GH1提高8～10℃。首次采用协同诱变的方法成功选育了虾青素高产酵母菌株,并且生长周期短,最适的生长温度提高,是适宜南方高温环境发酵工程应用的优良菌株。     

sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究

旨在研究sco1135基因缺失突变对天蓝色链霉菌M145菌株形态及次级代谢的影响。通过PCR-targeting方法获得重组质粒p SJ1135,通过接合转移将其导入天蓝色链霉菌M145,获得sco1135基因缺失突变菌株△sco1135,并以p MS82为载体构建回补菌株△sco1135com,同时以p MS82为空载对照;随后对野生型菌株、突变菌株和回补菌株进行表型分析和抗生素定量观察。结果显示,表型分析及抗生素定量测定发现,在YBP培养基上△sco1135产孢明显延迟于野生型M145,放线紫红素(ACT)产量明显增加,突变株培养基中ACT产量是野生菌株培养基中的2-3倍;转录分析结果表明,48 h时突变株部分与产孢相关基因的转录水平较野生型降低了50%-75%,72 h时突变株部分与产ACT相关基因的转录水平较野生型提高13-20倍。sco1135基因参与调控M145的孢子形成及次级代谢产物ACT的产生。     

氯化锂诱变选育3-羟基丙酸高产菌株

本文以实验室筛选得到的翰逊德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii)DH01为出发菌株,利用氯化锂诱变选育3-羟基丙酸(3HP)产量高并且可以用于实际生产的突变株。经过两轮氯化锂诱变,筛选得到一株产酸量较高的菌株wt06。在培养温度为28℃,120 r/min的条件下,经过48 h培养后,该菌株3HP的产量最高达到23.70 g/L,是原始菌株产量的5.44倍,且该菌株具有良好的遗传稳定性。     

阿维链霉菌的诱变育种

以阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76-12为出发菌株,采用亚硝基胍、吖啶橙、紫外线和氯化锂分别对其孢子和原生质体进行诱变,经抗代谢物理性筛选,获得一系列高产突变株,其中N-1-2高产突变株的发酵单位是出发菌株的2.47倍。实验中同时获得了只产阿维菌素a组分的突变株G-32、Bla组分含量高的Ave8菌株和产蓝绿色孢子的突变株UA-G等。