葡萄糖异构酶及其在高果糖浆生产中的应用

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase,GI)能催化D-葡萄糖的异构化反应,生成D-果糖,是目前工业上制备高果糖浆(HFCS)的关键酶之一。本文对GI的来源、分类、高级结构特征和催化机制进行了介绍,并从GI催化功能的改善、基因工程菌的构建和固定化三个方面对GI在HFCS生产中应用的关键技术和策略进行分析。     

大肠杆菌D一木糖异构酶基因的分子克隆与表达

经DNA体外重组,并以D-木糖异构酶缺陷型菌株互补加以检定,获得了大肠杆菌D-木糖操纵子克隆．通过次级克隆,分离得到了D-木糖异构酶基因克隆。为试图提高酶活力,将含有D-木糖操纵子和异构酶基因的克隆DNA片段,分别克隆若干个高拷贝质粒上,并且观察了不同宿主对基因表达的影响。实验结果表明,D-木糖操纵子和D-木糖异构酶基因在不同大肠杆菌菌株细胞中均能表达。     

葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

D-葡萄糖异构酶(GI)能分别催化D-葡萄糖和D-木糖异构为D-果糖和D-木酮糖. 它是工业上生产高果糖浆的关键酶. 在GI负氢离子转移机制中,其主要特征是底物的开环、通过C₂至C₁间负氢离子转移的GI异构化作用、以及产物的闭环. GI基因已在同源、异源宿主中获得克隆、测序和超量表达. 经过蛋白质工程改造的GI将是未来最重要的工业用酶之一.     

木糖异构酶的结构及蛋白质工程

木糖异构酶的结构及蛋白质工程肖亚中,伍传金,崔涛（中国科学技术大学生物系合肥２３００２６）关键词木糖异构酶,结构与功能,蛋白质工程木糖异构梅（Ｄ－ＸｙｌｏｓｅＩｓｏｍｅｒａｓｅ,ＥＣ５。３。１。５,下简称ＸＩ）催化五碳Ｄ－木糖转化为Ｄ－木酮糖,在体外亦能催化六碳Ｄ－葡萄糖至Ｄ－果糖的异构化反应［１,２］。该反应是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键步骤［３］,故习惯上将木糖异构酶称为葡萄糖异构酶 。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

链霉菌MIUG4.46胞内葡萄糖异构酶的提取条件研究

比较了采用不同方法处理链霉菌MIUG4．46的生物量时,细胞内葡萄糖异构酶的释放能力。当联合采用溶菌酶和高压力来破碎细胞时,提取物中葡萄糖异构酶的总酶活力为91．3％,酶的回收率为87％。用溶菌酶溶菌和高压破碎细胞后,在Mg~(2＋)和Co~(2＋)存在的情况下,对细胞悬浮液进行热处理（70℃下加热10min）时,有利于提高提取物中葡萄糖异构酶的纯度,酶的比活力达3．275U／mg蛋白质。     

重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖

【背景】D-甘露糖的酶促转化方法已受到相当大的关注。【目的】研究D-葡萄糖异构酶(D-glucoseisomerase,D-GIase)和D-来苏糖异构酶(D-lyxoseisomerase,D-LIase)共表达于大肠杆菌细胞生产D-甘露糖的工艺条件。【方法】将D-GIase和D-LIase基因片段合成后酶切连接到载体p CDFDuet-1上,构建p CDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,通过摇瓶培养得到产D-GIase和D-LIase的菌体,测定该共表达细胞体系的反应条件。【结果】添加1 mmol/L Co~(2+),共表达体系酶的最适温度和p H分别为70°C和6.0。以浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖,平衡后D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L,相应的转化率分别为13.8%、12.7%、12.5%,D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。【结论】D-GIase和D-LIase在大肠杆菌细胞中组成的共表达体系通过一锅法可利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。     

用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶.方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi).用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体.通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi).在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶.用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析.结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用.结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础.     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

【背景】D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。【目的】克隆一个链霉菌(Streptomycessp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备D-甘露糖。【方法】从链霉菌(Streptomycessp.)中发掘一个D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA),构建重组表达质粒pET-28a-ssMIaseA并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后测定酶学性质,利用高效液相色谱对SsMIaseA制备D-甘露糖进行研究。【结果】SsMIaseA与嗜热裂孢菌(Thermobifda fusca)来源的D-甘露糖异构酶ManI相似性最高,为60.2%。该酶比酶活为525 U/mg,分子量约为45 kD,最适pH和温度分别为7.5和45°C,在pH 6.5-10.0范围内和45°C以下保持稳定。该酶对甘露糖具有最高催化活性,其次是果糖、塔罗糖和塔格糖。利用SsMIaseA转化600 g/L D-果糖,反应8 h达到平衡,生成185 g/L D-甘露糖,转化率为31%。【结论】SsMIaseA作为新型D-甘露糖异构酶为D-甘露糖的酶法制备奠定了基础。     

短乳杆菌葡萄糖异构酶固定化的研究

采用离子交换树脂ＤＥＡＥ纤维素对短乳杆菌葡萄糖异构酶进行固定化,并用固定化细胞使葡萄糖异构化为果糖,研究了制备固定化细胞最佳条件,而且与戊二醛交联法,海藻酸钙包埋法作了比较。还研究了固定化细胞的性质及连续转化的最佳条件,用ＤＥＡＥ纤维素固定化具有酶活力高,回收率高,机械强度好,成本低等优点。     

代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建

为了使谷氨酸棒杆菌较好地利用木糖生产有机酸,将来自Escherichia coli K-12的木糖异构酶基因xylA构建到表达载体pXMJ19中,导入Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δldh中,成功表达了该酶基因。结果表明:重组菌株在以木糖为唯一C源进行发酵时,木糖的消耗速率为0.54 g/(L·h),木糖异构酶比酶活约为0.54 U/mL;在以木糖和葡萄糖的混合糖为C源进行发酵时,菌株优先利用葡萄糖,在葡萄糖完全消耗后,菌株开始有效利用木糖;以木糖为唯一C源进行两阶段发酵时,琥珀酸的收率可达(0.62±0.003)g/g。     

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达

为了增加高热稳定性的葡萄糖异构酶的得率,采用PCR技术扩增得到Thermus thermophilusHB8葡萄糖异构酶基因xylA,连接到表达载体pET-22b( )上,获得重组质粒pET-22b( )-xylA。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测葡萄糖异构酶酶活。重组菌经诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子量约为44 kD特异性蛋白质条带,比酶活约为18.562 U/mg,比野生型菌株提高了2倍。     

链霉菌M1033 D－木糖异构酶的分子克隆

链霉菌M1033染色体DNA经BamH Ⅰ酶解后电泳,Southern转移。根据自测的链霉菌M1033 D－木糖异构酶氨基酸序列设计合成寡聚核苷酸探针x－2、x－3,以x－2、x－3及Am－pullariella sp3876 D-木糖异构酶基因(1．17kb)为探针进行杂交,确定与上述探针杂交最强处在15kb左右。从胶上分离出g-20kb大小的片段,克隆到EMBL 3载体中,经杂交筛选后,得到0．6％的阳性噬斑,其插人大小为13kh。将插入DNA的saIⅠ酶解片段(2．5kb)进一步亚克隆于pucl8,得到重组质粒puB l,经酶解图谱、部分序列分析和互补实验确定puBl含有完整的M1033 D-木糖异构酶基因     

产葡萄糖异构酶工程菌工业发酵条件模拟研究

高效表达葡萄糖异构酶的大肠杆菌工程菌Ｋ３８／ｐＧＰＩ－２,ｐＴＫＤ－ＧＩ菌株,在玉米浆培养基中能高效合成葡萄糖异构酶,观察了细菌生长的细胞浓度（ＯＤ）、ｐＨ和酶产生的动态变化。玉米浆培养基成本低、制备工艺简单,在５０Ｌ发酵罐中酶活力为１４３ｕ／ｍＬ,比在ＬＢ培养基中高约１０倍。用超声波破碎细胞液作酶源吸附于大孔阴离子交换树脂制成固定化葡萄糖异构酶、其酶活力达到１０２００ｕ／ｇ（干）。     

不吸水链霉菌葡萄糖异构酶的物化表征

葡萄糖异构酶是一种催化葡萄糖异构为果糖的酶。本文用紫外吸收光谱、红外光谱、氨基酸组分分析、聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、超薄 层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳技术研究了不吸水链霉菌嗜热亚种M1033菌株产生的葡萄糖异构酶的一些物化性质。结果表明由本实验室制备的均一葡萄糖异构酶的A₂₈₀与A₂₆₀的比值是1.76。它是由一个亚单位组成的酶分子。最小分子量是49000。pI值是5.2。氨基酸组分与其它来源的葡萄糖异构酶的氨基酸组分相比较有一些差异,其中Glu,Gly,ALa和Leu的含量都此其它异构酶的高,而Met,Trp,Asp,Thr则比其它葡萄糖异构酶的低。     

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株木糖异构酶晶体结构研究

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株木糖异构酶(SDXyI).19nm分辨率晶体结构已经解出.晶体空间群为I222,晶胞参数为a=9.884nm,b=9.393nm,c=8.798nm.参考锈赤链霉菌木糖异构酶(SRXyI)的晶体结构模型,通过分析晶体密堆积关系和晶体学R因子搜索,获得了SDXyI晶体结构的初始模型.采用PROLSQ软件包使用0.60～0.19nm分辨率衍射数据对模型进行了修正.最终模型的晶体学R因子为0.177,键长键角均方根偏差分别为0.0019nm和2.1°.与SRXyI相比较,SDXyI整体构象未发生明显变化,活性中心构象有显著差异.     

生物法生产D-塔格糖的研究进展

D-塔格糖具有多种独特的生理特性与功能,近年来已被发达国家开发作为具有高经济附加值的功能性甜味剂进行销售。D-塔格糖的商业化生产长期以来依赖化学催化法,随着20世纪90年代利用L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶)催化D-半乳糖制备D-塔格糖技术的兴起,生物法生产D-塔格糖成为了新的发展趋势。结合笔者所在课题组近年来的研究成果,就D-塔格糖生物法生产工艺的研究现状和前景进行综述与展望。     

产葡萄糖异构酶工程菌工业发酵条件模拟研究*

高效表达葡萄糖异构酶的大肠杆菌工程菌Ｋ３８／ｐＧＰＩ－２,ｐＴＫＤ－ＧＩ菌株,在玉米浆培养基中能高效合成葡萄糖异构酶,观察了细菌生长的细胞浓度（ＯＤ）、ｐＨ和酶产生的动态变化。玉米浆培养基成本低、制备工艺简单,在５０Ｌ发酵罐中酶活力为１４３ｕ／ｍＬ,比在ＬＢ培养基中高约１０倍。用超声波破碎细胞液作酶源吸附于大孔阴离子交换树脂制成固定化葡萄糖异构酶、其酶活力达到１０２００ｕ／ｇ（干）。     

嗜热链霉菌变株M1033—9葡萄糖异构酶的研究II．酶的性能与工业应用

嗜热链霉菌变株(Streptomyces diastaticus No.7mutant strain)M1033—9菌的胞外葡萄糖异构酶作用最适温度为80—85℃,最适pH为8—9,pH大于7．8时有较强的热稳定性,Co2+和Mg2+对酶有激活作用,Co2+对酶的热稳定性有保护作用。5000L发酵罐经板框过滤的清发酵液含胞外酶885u／ml,占总酶活94％,可直接作酶源吸附于大孔阴离子交换树脂上制成固定化葡萄糖异构酶(酶活13000u／g(干))工艺简便。年产2000吨42型果葡糖浆规模下每公斤干固定化酶可生产果葡糖浆4 59吨。M1033—9是产胞外葡萄糖异构酶的优良菌种。