酿酒酵母中双链RNA介导基因沉默技术研究GRE3基因表达抑制

RNA沉默技术作为探索基因功能的实验手段应用于多种生物.以编码酿酒酵母NADPH依赖型醛糖还原酶的GRE3基因为对象,检测酿酒酵母双链RNA介导的基因沉默效应.以pESC-LEU为骨架,构建重组质粒psiLENT-GRE3并用于转化酿酒酵母YPH499.用RT-PCR检测到诱导1 kb RNA双螺旋和136 bp loop结构引起的GRE3基因表达下调.结果表明,双链RNA介导的基因沉默技术,能够用作降低酿酒酵母某一特定基因表达水平的工具.并有助于理解芽殖酵母的RNA干扰现象.     

酿酒酵母中双链RNA介导基因沉默技术研究GRE3基因表达抑制

RNA沉默技术作为探索基因功能的实验手段应用于多种生物. 以编码酿酒酵母NADPH依赖型醛糖还原酶的GRE3基因为对象，检测酿酒酵母双链RNA介导的基因沉默效应. 以pESC-LEU为骨架，构建重组质粒psiLENT-GRE3并用于转化酿酒酵母YPH499. 用RT-PCR检测到诱导1 kb RNA双螺旋和136 bp loop结构引起的GRE3基因表达下调. 结果表明，双链RNA介导的基因沉默技术，能够用作降低酿酒酵母某一特定基因表达水平的工具. 并有助于理解芽殖酵母的RNA干扰现象.     

人脑醛糖还原酶的纯化和一些基本性质

使用DEAE纤维素柱层析、PBE-94层析聚焦、NADP~+-Sepharose 4B亲合层析及SephadexG-100凝胶过滤分离纯化了人脑醛糖还原酶。在DEAE层析中,用咪唑-HCI缓冲液替代了磷酸缓冲液,改善了分离效果。在聚丙烯酰胺及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,纯化的人脑醛糖还原酶均呈一条区带。它的pI为5.6,最适pH为6.5,分子量为36,000,底物特异性和氨基酸组成与其它哺乳动物的醛糖还原酶有相似性。开链式醛糖是醛糖还原酶的真正底物,它在开链式和半缩醛的平衡体系中占比例极小,因而推知醛糖还原酶对此底物有很高的K_(cat)和K_(cat)/K_m值,能有效地将它们还原成相应的醇。     

人脑醛糖还原酶的纯化与性质

联合采用ＤＥＡＥ－纤维素层析、色谱聚焦、ＮＡＤＰ亲和层析与ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００的凝胶过滤,对人脑醛糖还原酶（ＥＣ１．１．１．２１;ＡＬＲ）进行纯化．现测得该酶的等电点ｐＨ值为５．８５．经聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实,获得了满意的酶纯度．同葡萄糖,葡糖－６－磷酸与ＮＡＤＰＨ保温后,人脑ＡＬＲ纯品的活性与对照酶组相似,且不被糖酵解途径的一些磷酸化中间产物抑制．苯基硼酸琼脂糖柱层析洗脱谱峰和氢硼化钠还原反应提示,当同葡萄糖保温时,人脑ＡＬＲ（特别是其均一态）可能未被进一步糖基化．在糖尿病并发症和按结构完成药物设计的研究工作中,纯品ＡＬＲ的应用可发挥重要作用     

mel基因在酿酒酵母菌中的克隆和表达*

构建了含mel基因的重组质粒pAJM,并转化到酿酒酵母菌中,获得了在平板上产生黑色表型的转化重组子,为酵母菌的遗传操作提供了一种新的选择标记。由于mel基因经酪氨酸产生的黑色素无毒、无害,安全稳定,无需另外加显色化合物或使用特殊的仪器设备,直接在平板上观察结果。因此,是一种便捷、价廉、无污染的新型报告基因。此外,实验中还发现含mel基因的酵母菌生长迅速,这不仅作为报告基因更能显示其优势,而且也为进一步研究其在酵母菌中的功能提出了新的内容。     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2酮基醛糖还原酶A和B(2KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR322上,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2酮基古龙酸(2KLG)打下基础。     

醛糖还原酶基因5′调控区新的点突变对基因表达调控的影响

为了进一步研究醛糖还原酶 (AR)基因 5′调控区存在的可引起蛋白质表达发生改变的遗传变异及其对糖尿病并发症的影响 ,应用PCR SSCP对中国人 2型糖尿病患者的AR基因 5′调控区进行筛选 ,在两名糖尿病患者中发现一新点突变C- 1 6 7→A ,使AR基因 5′调控区产生一个新的CCAAT盒。含点突变的两名患者尽管患病多年 ,长期处于高血糖状态 ,但无糖尿病并发症发生。而且他们的红细胞中AR活性都很低 ,处于无视网膜病变患者组的下限范围。将含野生型和点突变DNA片段分别克隆至氯霉素乙酰转移酶报告基因载体 (pCAT) ,检测CAT的活性确定野生型和突变型序列的转录活性。同时进行凝胶滞留试验以观测DNA与蛋白质的相互作用。结果显示 :含C- 1 6 7→A的启动子相对转录活性 (5 .7% )明显低于野生型(15 .7% )。凝胶滞留试验中 ,突变序列迁移速率较野生型慢。以上结果说明 ,AR基因 5′调控区C- 1 6 7→A点突变干扰了启动子区顺式作用元件与反式作用因子的结合 ,导致AR基因转录活性降低 ,使患者组织中AR活性下降 ,从而阻止或减缓 2型糖尿病视网膜病变发生发展。     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用ＰＣＲ技术,从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＣＢ１２５染色体中重新扩增得到含有２－酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２－ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＢＨ５α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到ｔｋｒＡ内部使其突变失活     

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达

采用PCR法克隆了巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）CpN86菌株编码1,3丙二醇氧化还原酶基因（dhaT基因）;完成了dhaT基因测序、表达载体构建和在大肠杆菌中表达;分离和纯化了dhaT基因表达的重组蛋白。实验结果：（1）PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae菌株dhaT基因的序列同源性为829%;（2）dhaT基因表达蛋白的酶活为108U/mg;（3）dhaT基因表达的蛋白分子量为43kD;（4）Western blot确定了dhaT基因表达的蛋白和 CpN86菌株天然蛋白有相同的抗原反应。     

HBV preS/S基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

目的:探索利用酿酒酵母系统表达乙型肝炎病毒(HBV)preS／S基因。方法:利用PCR技 术,以HBV病毒DNA为模板,体外扩增HBV preS／S基因。然后构建重组表达载体pESC-preS／S。 用LiAc法转化酿酒酵母YPH50,选取重组菌进行培养,并诱导表达外源蛋白。提取蛋白浓缩后 进行SDS-PAGE分析,并经Western blot分析鉴定。结果:实验结果表明重组菌能够表达HBV preS／S蛋白。结论:利用酿酒酵母系统可成功表达HBV preS／S基因,为制备新型预防性疫苗提供 条件。     

Inhibition of lens aldose reductase by flavonoids

The inhibitory activities of 73 flavonoids against rat aldose reductase were systematically investigated and cosmosiin, luteolin-7-glucuronide, lonicerin, 6-hydroxyluteolin, kaempferol-3-rhamnoside and avicularin were newly found to be highly active. The degree of inhibition appears to depend on the solvent system used. In general flavones are more active than flavonols and flavanones, glycosides are more active than aglycones, and the number of sugars present affects the activity.     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

E.coli木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化

采用PCR技术以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板扩增得到木糖异构酶基因xylA,连接到载体pET-22b( ),得到重组质粒pET-22b( )-xylA。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测得木糖异构酶活力。每mL发酵液中重组菌株显示出酶活力约为0.84 U。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的5×104(相对分子质量)特异性蛋白质条带。     

The use of dimethylsulfoxide as a solvent in enzyme inhibition studies: the case of aldose reductase

Aldose reductase (AR) is an enzyme devoted to cell detoxification and at the same time is strongly involved in the aetiology of secondary diabetic complications and the amplification of inflammatory phenomena. AR is subjected to intense inhibition studies and dimethyl sulfoxide (DMSO) is often present in the assay mixture to keep the inhibitors in solution. DMSO was revealed to act as a weak but well detectable AR differential inhibitor, acting as a competitive inhibitor of the L-idose reduction, as a mixed type of non-competitive inhibitor of HNE reduction and being inactive towards 3-glutathionyl-4-hydroxynonanal transformation. A kinetic model of DMSO action with respect to differently acting inhibitors was analysed. Three AR inhibitors, namely the flavonoids neohesperidin dihydrochalcone, rutin and phloretin, were used to evaluate the effects of DMSO on the inhibition studies on the reduction of L-idose and HNE.     

人血管抑制素在酿酒酵母中的分泌表达和活性鉴定

将酵母交配因子 (MF)α1信号肽编码序列和人血管抑制素 (hAGN)cDNA融合序列插入穿梭载体pYADE4 ,构建得到分泌型重组表达质粒pYADEMA18.转化酿酒酵母JG110 7后 ,用 2 %乙醇和2 %甘油联合诱导表达 .ELISA分析表明 ,在诱导 14h～ 30h期间 ,hAGN获得了表达并分泌至细胞外 .发酵上清液经 75 %饱和度硫酸铵沉淀、CM 5 2纤维素离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析纯化 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物重组人血管抑制素 (rhAGN)相对分子质量约 5 0kD ,电泳纯度达到 94 %.生物活性分析证明 ,rhAGN在 0 0 1mg L～ 3 0mg L浓度范围内能够抑制人真皮内皮细胞株HDMEC增殖 ,抑制作用随剂量的增加而增强 .