肺炎克雷伯杆菌疫苗中试生产中细菌培养工艺的改进及优化

目的中试生产中对肺炎克雷伯杆菌培养工艺进行改进及优化。方法采用液体综合培养基代替半综合培养基在10L和100L中国丽生物反应器中对肺炎克雷伯杆菌进行培养,在10L中国丽生物反应器探讨不同的培养基配方、pH值、培养温度、搅拌转速、溶氧,工艺参数稳定后,扩大培养到100L中国丽生物反应器,并探讨培养过程中补加葡萄糖的浓度及补加方式等对细菌浓度及荚膜多糖含量的影响。结果肺炎克雷伯杆菌液体综合培养基可代替半综合培养基用于该菌的培养,培养过程中维持pH值7．2、温度37℃、通气60L／h、搅拌转速250r／min、培养到2h时开始以恒速补加30mL／L40％葡萄糖溶液、培养时间为5h,细菌长势最好,收获的荚膜多糖含量最高。结论肺炎克雷伯杆菌的培养工艺放大到100L中国丽生物反应器中,经过多次试验初步建立了稳定的肺炎克雷伯杆菌中试培养工艺。     

氧化亚铁硫杆菌分离复壮及固定化的研究

用稀释涂布平板法从已退化的氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）菌液中分离出氧化活性较高、生命力强的氧化亚铁硫杆菌T1。以H2软性填料作为氧化亚铁硫杆菌的固定化载体,构建了固定床生物反应器。考察了固定床生物反应器氧化Fe2+的情况：Fe2+最大氧化速率达7.67g/(L·h)。并对固定床生物反应器运行过程中在载体表面形成的沉淀物进行了研究,通过X衍射证明此沉淀物为黄钾铁矾［Kfe3(SO4)2(OH)6］。     

不同能源条件下中度嗜热嗜酸细菌多样性分析

采用黄铁矿、黄铜矿、硫酸亚铁和硫粉混合物作为主要能源物质在50°C条件下分别培养中度嗜热细菌混合物,研究其细菌多样性。提取细菌基因组总DNA,采用PCR结合限制性酶切片段多态性分析(RFLP)方法进行细菌16SrRNA基因的系统发育分析,比较不同能源条件下富集培养的混合细菌群落构成的差异。从3个培养物中共获得阳性克隆303个并进行RFLP分析,对29种不同酶切谱型的克隆插入序列进行测定和系统发育分析。大部分序列与已报道的浸矿微生物16SrRNA序列相似性较高(89.1%~99.7%),归属于硫化叶菌属的耐温氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermotolerans)和热氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans),嗜酸硫杆菌属的喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus),钩端螺旋菌属的嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)以及unculturedforest soil bacterium、uncultured proteobacterium。其中Acidithiobacillus caldus,Sulfobacillus thermotolerans,Leptospirillumferriphilum3种细菌为三类能源物质培养物中的优势细菌类群。L.ferriphilum在黄铁矿培养体系(53.8%)和硫酸亚铁和硫粉为能源的培养体系中(45.9%)中丰度最高;在以黄铜矿为能源物质的培养体系中,S.thermotolerans的比例大幅上升(70.1%)。关键词:中度嗜热细菌;生物多样性;生物浸矿;喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus);耐温氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermotolerans);嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)     

氧化亚铁硫杆菌的形态及对Fe2+的氧化研究

在纯培养的条件下,对江西德兴铜矿酸性矿坑水中分离出的一株氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的细胞形态、生长条件以及对Fe2 的氧化进行了初步研究。透射电子显微镜检查的结果表明,其成熟菌体大小均一,有较好的运动性;采用光学显微镜对微生物进行菌群观测和利用血小板计数器法对细菌计数的结果表明,在摇床转速为160r/min的条件下,T.f.菌在9K液体培养基中最适生长条件为温度30℃左右,最佳初始pH 2.0;用重铬酸钾滴定法测定铁的结果表明,在摇床转速为160r/min的条件下,pH值1.7,温度30℃时T.f.菌对Fe2 的氧化速率最大,约为0.58g/L·h。     

氧化硫硫杆菌的研究进展

综述了氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans,T.t)培养方法和应用方面的研究进展。     

光径及氮浓度对缺刻缘绿藻生长、油脂和花生四烯酸积累的影响

以缺刻缘绿藻(Parietochloris incisa)为实验材料, 采用BG-11培养基, 分别在2种氮浓度和3种不同光径(LP)的柱状和平板光生物反应器中进行培养, 并探究其生长、油脂和花生四烯酸(AA)的积累规律。结果显示: 在两种光生物反应器中, 光径越小, 越有利于缺刻缘绿藻的生长。其中, 最大生物量均在17.6 mmol/L氮浓度时获得, 分别为5.09 g/L(2.5 cm-柱状)和2.98 g/L(3.0 cm-平板); 而最高油脂和AA绝对含量则均在1.0 mmol/L氮浓度和最大光径处获得, 分别为39.23%、13.21%(6.0 cm-柱状)和40.74%、11.33%(5.0 cm-平板); 另外, 两种光生物反应器中的最大油脂单位体积产率分别可以达到216.39 mg/(L·d)(17.6 mmol/L; 2.5 cm-柱状)和135.93 mg/(L·d)(1.0 mmol/L; 1.5 cm-平板); 而最高的AA单位体积产率均在1.0 mmol/L低氮条件, 最大光径处达到最大, 分别为21.65 mg/(L·d)(6.0 cm-柱状)和19.42 mg/(L·d)(5.0 cm-平板)。因此, 根据实际生产需要, 在1.0 mmol/L低氮条件下, 选择6.0 cm光径的柱状光生物反应器或5.0 cm光径的平板光生物反应器, 培养缺刻缘绿藻生产AA, 能有效降低生产成本。     

氧化亚铁硫杆菌胞外多聚物在生物浸出中的作用

氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是一种重要的浸矿微生物。它与矿物的界面作用机理是复杂的,涉及物理化学的和生物化学的参数。本文运用电镜细胞化学方法对氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的胞外多聚物(EPS)的脂类、多糖、蛋白质等生物大分子以及铁离子进行了研究,并探讨了EPS与吸附、生物膜形成的关系以及生物膜在浸矿过程中的作用。     

氧化亚铁硫杆菌及其硫氧化机理

烟气SO2引起的酸雨污染是当代世界面临的重大环境问题之一。对烟道气脱硫用微生物—氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)进行了介绍,并在文献分析的基础上,对T.f催化氧化S(IV)机理进行了讨论。     

天然Fe(Ⅱ)矿物-生物质强化微生物还原固定五价钒研究

【目的】重金属钒的环境危害日益受到关注,微生物可实现高毒性的五价钒[pentavalent vanadium, V(Ⅴ)]的还原固定,其中电子供体是微生物还原V(Ⅴ)的关键,尽管天然Fe(Ⅱ)矿物和天然生物质均被报道可单独支持微生物还原V(Ⅴ),而基于两者构建的混养体系中微生物还原V(Ⅴ)的特征尚未揭示。【方法】本研究对天然Fe(Ⅱ)矿物和生物质进行优选并复配组合,探究混养生物体系中五价钒[V(Ⅴ)]的还原机理。【结果】磁黄铁矿和木屑对V(Ⅴ)的去除效率最高,分别为54.2%±3.4%和67.1%±3.1%。当优选的磁黄铁矿与木屑组合复配比例为1:3时可达到最高的V(Ⅴ)去除效率82.7%±3.1%。V(Ⅴ)被还原为不溶性V(Ⅳ)沉淀,Fe(Ⅱ)和S(–Ⅱ)分别被氧化为Fe(Ⅲ)和SO₄^2-。在混养体系中,脱硫菌(Desulfurivibrio)和硫菌属(Thiobacillus)等自养菌属可能参与磁黄铁矿的氧化与V(Ⅴ)还原,并利用无机碳源合成有机中间代谢产物,与无胆甾原体属(Acholeplasma)等纤维素降解菌分解木屑的产物一起,被B...     

蜘蛛神经节的解剖与神经细胞的分离培养

报道了虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)食道下神经节的解剖以及神经细胞的分离培养方法。为开展蜘蛛神经生物学实验方法的研究,创立了一种蜘蛛神经细胞解剖方法——去胸甲解剖法。神经节细胞培养基为NaCl2 23 mmol/L;KCl6.8 mmol/L;CaCl28 mmol/L;MgCl2 5.1 mmol/L;Sucrose 5 mmol/L;Hepes 10 mmol/L;谷氨酰胺1mmol/L;青霉素200IU/ml;链霉素200μg/ml;小牛血清20%;pH7.4。在温度(27±2)℃的培养箱中培养2~4h。实验结果表明与传统方法相比较,去胸甲解剖法具有取材简便、准确、快捷和高效的特点。改进的培养基非常适合蜘蛛离体神经细胞的培养。培养的细胞状态好、数量多,细胞体呈椭圆形,细胞形状近似汤勺,有一个长的单极突起,其大小为10~30μm。     

产生物表面活性剂芽孢杆菌培养条件的优化

为了提高生物表面活性剂的表面活性,通过单因素及正交试验对已筛选的产生物表面活性剂芽孢杆菌的培养基及培养条件进行了优化,优化后的培养基成分为可溶性淀粉20 g/L,氯化铵2 g/L,KH2PO46 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO4.7H2O 0.3 g/L,NaCl 2 g/L,CaCl20.08 g/L,EDTA 0.4 g/L。培养条件为4%接种量,种龄16 h,初始pH7,培养温度37℃,摇床转速160 r/min,发酵48 h。优化发酵条件后,发酵液表面张力由初始67.5 mN/m降低至24.8 mN/m,生物表面活性剂产量达到1.08 g/L。     

嗜热甲酸甲烷杆菌602B_3与拟杆菌5G—102的混合培养

研究了嗜热甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium thermoformicicum)602B_3与发酵糖蜜产生C0_2和H_2的拟杆菌(Bacteroides sp.)5G-102的人工可配伍性。确定了它们混合培养的适宜培养基组分为(g/L):CaC0_3 50.0,NaHCO_3 4.0,Na_2S 0.16,NH_4Cl 1.07,K_2HPO_4 1.04,MgCl_2 0.19,糖蜜40(V/V),自来水IL,起始pH 6.8～7.2。混合培养物在60℃培养48h,甲烷产量达到最高,约45mmol/L。人工混合培养成功为进一步研究其在提高石油采收率工艺中的可用性提供了前提。     

高产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建和发酵条件优化

为了实现γ-氨基丁酸(GABA)在微生物中"一步法"高效生产,本研究构建出一株高产GABA的谷氨酸棒杆茵工程菌ATCC 13032/pDXW10-gadB1-gadB2,可以直接将自身合成的L-谷氨酸转变成GABA,并对该工程茵的发酵培养基和发酵条件进行了初步优化。结果表明:培养7 h~8 h的种子液按发酵起始OD_(562)=1.6转接至发酵培养基(葡萄糖、玉米浆分别100 g/L、4 g/L),10 h添加PLP至O.1 mmol/L,发酵结束后胞外GABA可达(26.39±1.68)g/L。为工业化"一步法"生产GABA提供理论和实验基础。     

农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立

以兼具生态和能源植物功能的木本模式植物——杨树(河北杨)为材料,研究了携带促生长基因(35S-DAS5)的根癌农杆菌载体介导的河北杨遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示,较适宜的转化系统为预培养2-4 d,农杆菌菌液(OD600值为0.4)侵染20 min,共培养4 d,在含30 mg/L卡那霉素(Km)的培养基上诱导不定芽,生根培养基中Km的适宜浓度为10 mg/L。     

用硅胶平皿分离及定量计数氧化亚铁硫杆菌

应用硅胶平皿分离、纯化某些土壤微生物,尤其是在琼脂培养基上生长不好的自养细菌,日渐引起人们的重视。我们在分离氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus     

表达重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞灌流培养基的筛选

目的筛选重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞株培养和连续灌流表达用培养基,以提高抗体表达量。方法通过调整原有批培养用培养基中谷氨酰胺和植物水解蛋白,获得5种培养基配比。使用模拟灌注方式进行细胞培养,分析细胞密度、活细胞比率和目标蛋白表达,筛选连续灌流细胞培养和表达用培养基。最后在7 L反应器中采用灌注培养方式对筛选获得的培养基进行验证。结果使用50 mL细胞培养管进行模拟灌注培养时,活细胞比率较高,达到90%以上;CHO细胞在添加谷氨酰胺至4.0 mmol/L和植物水解蛋白至5.0 g/L的批培养用培养基中生长速度最快;在基础培养基中抗体表达量比优化前高15%。20 d培养周期内,优化的培养基在7 L反应器中可以维持CHO细胞密度在(2 727±253)万个/mL,活细胞比率在95%以上。结论通过模拟灌注培养,筛选获得了一种在7 L反应器灌流培养中适宜于重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞表达的培养基。     

INS-1E细胞葡萄糖毒性模型的建立

目的:建立胰岛细胞系INS-1E细胞的葡萄糖毒性模型。方法:将INS-1E细胞分别在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、16.7mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)的1640完全培养基中培养不同时间(48 h、72 h、96 h、120 h),分别在不同时间点取细胞进行细胞功能检测,实时荧光定量PCR法检测胰岛素m RNA的表达,ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。结果:与对照组相比,高糖浓度(5.5 mmol/L、16.7 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)培养基中培养48 h后,INS-1E细胞的胰岛素合成和分泌的功能均增加(P均0.05),随着培养基中葡萄糖浓度的升高以及培养时间的延长,INS-1E细胞胰岛素合成及分泌的功能逐渐下降,当在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养基中培养120 h后,胰岛素m RNA合成及葡萄糖刺激的胰岛素分泌均显著降低(P均0.01)。结论:INS-1E细胞在30 m M的葡萄糖中培养120 h形成稳定的葡萄糖毒性模型。     

藏红花细胞悬浮培养体系的建立及优化

基于诱导的藏红花细胞系,通过摇瓶法,优化了其液体培养基、接种量和种龄等培养条件,以建立藏红花细胞悬浮培养体系。结果表明,将生长在固体培养基上的藏红花愈伤组织接种在MS液体培养基(添加了2mg/L2,4-D,1mg/L6-BA和300mg/LCH)中,于(22±0.3)℃,120r/min的摇床上,暗培养30d,便可获得藏红花的悬浮细胞系。经优化其培养基、接种量和种龄,将种龄为20d的细胞系,按照5%接种量接种在液体B5培养基(添加了2mg/LNAA,1mg/L6-BA和300mg/LCH)中,于(22±0.3)℃,120r/min的摇床上,培养36d,细胞生物量(13.4g/L)和藏红花素产量(0.91g/L)均达到最高。本研究建立的藏红花细胞悬浮培养体系为其生物反应器放大培养奠定了基础。     

厌氧E-MBR反应器在焦化废水处理中的微生物特性研究

【目的】将厌氧的膜生物反应器(MBR)与微生物燃料电池(MFC)耦合的厌氧电辅助膜生物反应器(E-MBR)应用于实际工业焦化废水处理。【方法】通过正交实验优化了反应器进水的培养条件为PO_4~(3–)14.3 mg/L、Fe~(2+)0.2 mg/L、Fe~(3+)0.1 mg/L、Co~(2+)0.1 mg/L和Mn~(2+)0.2 mg/L。在此条件下考察了该反应器对系统中有机污染物的去除效率及厌氧污泥的污泥特性、产电性能、胞外聚合物(EPS)、微生物群落结构及膜污染的影响。【结果】结果表明,与未优化的培养条件相比,工业焦化废水COD的去除率提高了23%;污泥浓度(MLSS)、比重、沉降速度增加,污泥体积指数(SVI)降低,表明污泥颗粒化及沉降性能提高;污泥中溶解性EPS (SMP)、松散态EPS (LB-EPS)及紧密结合态EPS (TB-EPS)这3种组分中的蛋白质与多糖的比例(P/C)分别降低0.12、0.25和0.16,表明污泥更易于被降解;厌氧污泥的产电性能增强;高通量分子测序结果表明,反应器中污泥的群落结构发生了明显的变化,优势菌群突出;经扫描电镜(SEM)对比结果表明,反应器阴极膜的污染情况也得到了一定的减缓。【结论】优化进水培养条件可以达到使反应器污水处理效率提高、清理周期缩短和运行更稳定等效果,对于工业废水处理技术的节能环保方面提供一定的理论依据。     

荷叶黄酮对乳酸杆菌和双歧杆菌抗氧化能力的协同作用研究

为研究荷叶黄酮对乳酸杆菌和双歧杆菌抗氧化能力的影响,0.25 mg/m L的荷叶黄酮添加至培养基培养保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus A105)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis B211),并提取细胞裂解液,依次从自由基清除能力、抗脂质过氧化能力及抗氧化物质活性三方面评估其抗氧化能力。结果显示,0.25mg/m L的荷叶黄酮提高了动物双歧杆菌(54.9%)及保加利亚乳杆菌(14.8%)对O-·2清除能力;其对保加利亚乳杆菌清除DPPH自由基能力稍有提升,对动物双歧杆菌清除DPPH自由基能力稍有抑制;其对保加利亚乳杆菌抗脂质过氧化能力提升率达658%,具有显著的协同增效作用。同时发现:经添加0.25 mg/m L的荷叶黄酮至培养基后,动物双歧杆菌和保加利亚乳杆菌胞内超氧化物歧化酶(SOD)酶活及谷胱甘肽(GSH)活力得到显著的提高。结果表明,荷叶黄酮的添加对保加利亚乳酸杆菌和动物双歧杆菌的抗氧化活性具有促进作用,且对保加利亚乳酸杆菌抗脂质过氧化能力具有明显的协同促进作用,可能与其胞内SOD酶活及GSH活力得到的显著的提升有关,具有潜在的应用价值。