小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及功能鉴定

利用PCR技术扩增小鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因启动子序列,构建小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1.经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法将pGL3-basic-HMGB1转入巨噬细胞264.7中,并应用萤光素酶测定系统检测其活性.检测结果显示pGL3-basic-HMGB1具有启动子活性.小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1的成功构建,为进一步研究HMGB1提供基本材料.     

黄鳝FOXL2启动子克隆和报告基因载体活性分析

本研究通过生物信息学软件预测黄鳝FOXL2 (Forkhead box L2)基因5′上游3 000 bp内的序列,通过聚合酶链反应从黄鳝的基因组DNA PCR扩增出启动子序列,并构建到PGL3-basic载体中,经KpnⅠ/HindⅢ双酶切和测序验证正确性,阳性克隆命名为pGL3-basic-FOXL2。将pGL3-basic-FOXL2和pRL-TK共转染HEK293细胞,采用双荧光素酶检测启动子活性。并采用gene-regulation.com网站的Alibaba2.1及The JASPAR database在线软件预测转录因子结合位点。结果表明成功克隆了FOXL2的启动子,荧光素酶检测结果表明启动子具有活性。同时预测了启动子上具有以下转录因子如GATA-1、Oct-1、AP-1、Sp1、C/EBPalpha、Ftz、Hb、GR、TBP、U SF、SOX9、E4、ER、RXR-beta、Pit-1a、HOX A4、HNF-1等的结合位点。为研究FOXL2参与细胞通路之间的调控研究提供了有力的工具。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

PDGF-C 3'UTR区荧光素酶报告基因载体构建

目的:构建不同长度包含目的片段的PDGFC 3`UTR双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节做准备。方法:培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞,提取腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的基因组DNA,以提取的基因组为模板,通过PCR扩增不同长度的PDGFC 3`UTR片段,经胶回收后,将回收的目的片段插入报告基因载体SV40-p GL3中,再经转化将克隆好的载体转入细菌内扩增(先在固体培养基上扩增为菌落,然后再接种进液体细菌培养管中扩增),扩增细菌后进行质粒提取,并进行菌落PCR及双酶切鉴定,最后送公司进行基因序列检测鉴定。结果:成功构建了不同长度目的片段的PDGFC 3`UTR的双荧光素酶报告基因载体。结论:本实验构建了不同长度的PDGF-C mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节打下了基础。     

MDR1基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析,为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法。方法从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y—box序列。将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3．Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8／VCR细胞中。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。利用MDRI基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响。结果通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y—box序列且没有出现碱基突变。在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5：5时,转染效率最高并具有最高的萤光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。结论MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功。该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDRI基因表达的机理,而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。     

徐州医学院病原生物学与免疫学教研室

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。     

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)是我国分布最广的蟑螂种类.黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)是我室1991年在国内首次报道并在国内外第一个分类鉴定的蟑螂细小病毒[1].我们构建了PfDNV全基因组克隆和酶切亚克隆重组质粒,测定并分析了病毒基因组全序列与结构.序列分析表明该病毒基因组具有细小病毒基因组的结构特征,其末端具有反转重复序列(Invert Terminal Repeatant, ITR)和回文结构,这类病毒基因组两端的特殊结构可能是与病毒复制,整合,拯救,包装有关的必需顺式元件[2～5].为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒基因复制及表达机理,尤其是其末端结构在病毒基因复制中的作用,我们将荧光素酶基因插入了PfDNV基因组保留了两个完整的末端结构而其它部分缺失的重组质粒中.将这种重组质粒转染虫体后,在虫体中检测到了荧光素酶的表达,说明在缺失基因组中间部分时,插入的外源基因依然可以复制、表达.本结果证实了PfDNV基因组的末端结构是PfDNV复制的必需结构.这一实验为将外源基因引入病毒基因组,构建基因工程杀虫剂提供了有效的技术途径.现将结果报告如下.     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

A luciferase gene has been inserted into the recombinant plasmid PfDNV-pUC119 which contained partly deletion of genome of Periplanete fuliginosa densovirus(PfDNV.)The recombinant plasmid with luciferase gene was co-transfrected with PfDNV-pUC 119 into Periplanele fuliginosa larvae and had a high luciferase gene expression in enteron of the transfected larvae.     

miR-126报告基因载体的构建及其功能鉴定

目的:根据miR-126的预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒,并进行功能鉴定。方法:利用sanger数据库提供的miR-126靶序列设计引物,PCR扩增目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)靶基因3'非编码区(three-prime untranslated regions,3'UTRs)序列,PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的pGL3-control载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,进行阳性克隆鉴定。同样,将候选靶基因3'UTRs突变,突变型3'UTR克隆入pGL3-control报告载体,构建野生型和突变型的报告基因重组质粒。将野生型和突变型的报告基因载体分别和化学合成的microRNA以及内参质粒共转染293TN细胞,进行双荧光素酶检测。结果:成功构建miR-126报告基因野生型和突变型重组质粒pGL3-VEGF-A-3'UTR和pGL3-VEGF-A-3'UTR,质粒测序及酶切结果完全正确。瞬时转染实验显示,过表达miR-126能直接抑制VEGF-A-3'UTRs报告基因活性。结论:miR-126对VEGF-A具有靶向调节功能。     

携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究

慢病毒是逆转录病毒科的一个属.它具有可以感染分裂期及非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、目的基因表达时间较长、免疫反应小等诸多优点,因此成为运载目的基因的理想载体而得到广泛的应用.构建了带有3种报告基因即红色荧光蛋白(mCherry)、荧光素酶基因(luciferase)及绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒载体,其中...     

二恶英反应增强子调控的虫荧光素酶报告基因质粒的构建

为加强二恶英类化学物质的快速筛选和半定量检测,我们构建了一在二恶英反应增强子调控下的虫荧光素酶报告基因质粒。二恶英反应增强子来源于pHAV质粒,MMTV启动子来源于pCatM质粒,上述两者连接后与虫荧光素酶载体连接,转染人HepG2肝癌细胞,以2,3,7,8四氯代二苯并二恶英(TCDD)诱导报告基因表达后检测虫荧光素酶活性。结果表明该质粒中虫荧光素酶的表达受二恶英反应增强子的调控,且在一定浓度范围内虫荧光素酶的活性与TCDD的量呈线性关系。研究显示该质粒转染的细胞株有望用于快速筛选及半定量检测二恶英,可进一步加强研究作为二恶英类化学物质监测的常规方法。