绒山羊70d胚胎与新生羊羔体侧部皮肤miRNA的比较分析

目的:最近发现miRNA对哺乳动物毛囊的发育和维持具有重要作用,研究miRNA在绒山羊次级毛囊发育中的作用,可以为人工调节绒毛生长和提高羊绒产量提供新的线索。方法:应用Exiqon miRNA8.1表达谱芯片对70d胎儿皮肤和出生2w羊羔体侧部皮肤组织差异表达的miRNA基因进行筛查,找出绒山羊皮肤发育不同阶段差异表达的miRNA。结果:绒山羊70d胎儿皮肤中相对于出生2w羊羔体侧部皮肤上调的miRNA 4个。绒山羊70d胎儿皮肤中相对于出生2w羊羔体侧部皮肤下调的miRNA 64个。结论:绒山羊70d胚胎皮肤中上调的miRNA远远少于出生后羊羔皮肤上调miRNAs,说明miRNA在皮肤毛囊不同发育阶段中发挥重要作用。     

青年羊驼耳部和背部皮肤组织中miRNA差异表达研究

羊驼是毛用型经济动物,其耳部和背部的毛发品质和生长速度存在差异.MicroRNA(miRNA)是新发现的一类在转录后水平调控基因表达的非编码RNA分子,为比较miRNA在羊驼耳部和背部皮肤的表达差异,从而探讨miRNA在羊驼皮肤和毛囊发育过程中的调控作用,本实验提取羊驼皮肤总RNA,制备了羊驼皮肤miRNA芯片,通过与Affymetrix多物种miRNA芯片跨物种杂交对耳部和背部皮肤的miRNA进行筛选,并通过实时荧光定量PCR进行了验证,同时利用在线生物信息软件预测miRNA靶基因.结果显示,羊驼耳部和背部皮肤中高表达差异2倍以上的miRNA有39个,实时荧光定量PCR检测let-7b和miR-24在2个部位皮肤中的差异表达量与miRNA基因芯片结果一致;预测到let-7b和miR-24的靶基因中包含有与毛囊生长发育和毛发品质相关的基因,提示这些miRNA可能参与羊驼皮肤和毛囊的生长发育、更新以及毛发品质的调控.     

Wnt通路中的部分基因在绒山羊胚胎皮肤毛囊中的表达分析

已知绒山羊毛囊的发育受Wnt等信号通路控制,但Wnt通路相关基因在绒山羊胚胎毛囊启动和生长发育过程中的表达及作用机制尚不清楚。本文采用RNA-Seq技术对45 d,55 d和65 d的绒山羊胚胎体侧皮肤进行了转录组测序,鉴定Wnt通路相关基因的表达。 RNA- Seq技术结合blast搜索,将转录组有效测序数据与云南黑山羊参考基因组序列(http://goat. kiz.ac. cn/GGD/download.htm)比对,获得了已知的Wnt通路（pathway hsa04310）中的123个相关基因（86.0%）。进而采用实时荧光定量PCR技术检测,验证了差异表达的Sfrp4、Wnt3、Wnt10a（上调）和Apc2（下调）基因在绒山羊胚胎不同时期皮肤中的表达量,初步探索了绒山羊毛囊在胚胎期启动、发育过程中,Wnt通路部分基因的表达模式,为进一步研究Wnt通路部分基因在绒山羊胚胎毛囊启动、发育过程中的作用机制提供了有意义的线索。     

山羊KAP6-1.2基因的克隆表达及分析

目的：研究角蛋白关联蛋白KAP6-1.2对不同品种羊绒和羊毛在核苷酸和氨基酸水平上的影响及在山羊皮肤中的定位表达。方法：以阿尔巴斯白绒山羊KAP6-1.2 cDNA设计特异引物,扩增5种山羊的KAP6-1.2基因的编码区,克隆并测序。制备KAP6-1.2 cRNA探针,通过组织切片原位杂交在皮肤中进行定位表达分析。结果：6种山羊的KAP6-1.2在核苷酸和氨基酸水平上高度同源,仅吐根堡奶山羊的编码区有2个碱基与其他5种山羊不同,导致编码的两个氨基酸残基也发生了改变。原位杂交结果显示,KAP6-1.2 mRNA在10月份皮肤、胚胎125d皮肤、胚胎115d皮肤初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。结论：KAP6-1.2的核苷酸序列和氨基酸序列在不同地区、不同品种山羊中高度保守,在胚胎和成年山羊皮肤的初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。     

山羊KAP8.2基因的克隆表达及分析

目的：研究不同品种山羊和驯鹿高甘氨酸,酪氨酸（HGTKAP8）I型蛋白KAP8．2在核苷酸和氨基酸水平的差异,以及KAP8．2mRNA在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达。方法：以阿尔巴斯白绒山羊KAP8．2设计特异引物,扩增马头山羊、吐根堡奶山羊、藏山羊和驯鹿KAP8．2基因的编码区,克隆测序并分析。体外制备地高辛标记的KAP8．2cRNA探针,通过原位杂交法在山羊皮肤组织切片上进行定位。结果：发现KAP8．2编码区在核苷酸和氨基酸水平的同源性较高,但也有差异,这可能是毛发性质不同的诸多原因之一。KAP8．2mRNA在成年10月份皮肤、胚胎125d皮肤初级和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达。结论：KAP8．2是胚胎和成年山羊皮肤初级和次级毛囊的皮质层的组成成分,不同地区、不同品种山羊及驯鹿的KAP8．2在核苷酸和氨基酸水平同源性较高。     

小鼠皮肤及其毛囊早期发育的组织学观察

目的探讨小鼠皮肤及其毛囊的早期发育规律。方法采用常规石蜡切片和H-E染色技术,观察昆明系小鼠出生前后皮肤及其毛囊的形态发育。结果(1)孕龄16 d胎鼠的皮肤表面形成凹凸不平的深褶皱,但在生后3 d~5 d不仅皱褶的数量减少,而且凹陷变浅;(2)胎鼠孕龄16 d至19 d,其皮肤的表皮、真皮及皮肤总厚度呈现平稳增厚。但是,出生后,其表皮、真皮和皮肤总厚度急剧降低;在生后第1天至第9天,表皮呈现平稳增厚,而真皮则在生后快速厚度,第7天达到最高值(1861.50μm);(3)孕龄16 d的胎鼠皮肤中可观察到初级毛囊,至生后第7天其密度呈现平稳增长;与其相比,次级毛囊从18 d胎鼠开始出现,其密度增长非常迅速,出生后第7天达到1257.14/mm;毛囊的总密度与次级毛囊呈现相似的变化趋势。出生第7天后,由于毛囊的数量急剧增加,无法观察初级毛囊和次级毛囊的变化规律;(4)初级毛囊和次级毛囊的长度与深度变化在出生前后的相对缓慢,与其相比在第3天以后至第7天呈现迅速变化趋势。结论小鼠皮肤及其毛囊的生长性发育发生在胎儿晚期和生后的早期,而其周期性变化可能从出生后的第9天以后开始出现;在孕期16 d至生后第7天可能是检测毛囊特异性基因表达的最佳期。     

日本七鳃鳗物种特异性microRNAs及其前体的识别与验证

MicroRNAs(miRNAs)对参与多种生物代谢过程的基因在转录及转录后水平进行负调控。近年来,随着深度测序及芯片技术的应用,有关miRNA的发现和功能分析在植物和动物中得到广泛研究。文章利用第二代测序技术对日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞的小RNA进行了高通量测序,共得到5 207 787条小RNA序列,其中4 739 346条序列可以拼接为10 989种mi RNA变体。基于序列相似性分析,发现这10 989个变体序列与306个已知的保守mi RNA家族成员序列相匹配;其中,6个保守miRNA家族成员呈极高丰度表达,表明mi RNA在物种间具有保守性。70个未注释序列被预测为新的miRNA。通过miRNA微阵列技术鉴定与验证了34个新预测的mi RNA在免疫处理的日本七鳃鳗白细胞中表达,其中16个mi RNA前体的最低折叠自由能系数大于0.85,说明日本七鳃鳗存在特异性miRNA。这些物种特异性miRNAs的存在可能在日本七鳃鳗的白细胞生长、发育和对疾病的反应中发挥重要的调控作用。     

褪黑激素对绒山羊皮肤中毛囊周期相关miRNAs表达模式的影响

褪黑激素(Melatonin, MT)和miRNAs在毛囊的生长发育过程中发挥重要的作用, 但MT对绒山羊皮肤毛囊miRNAs表达模式的影响尚未见报道。为探索MT从miRNAs层次影响山羊绒生长的机制, 文章在内蒙古绒山羊中实施了褪黑激素埋植试验：5只青年母羊作为实验组埋植褪黑激素, 另外5只青年母羊作为对照。利用荧光定量PCR检测褪黑激素埋植前后毛囊周期相关miRNAs的表达变化。结果表明, 埋植MT明显改变了6个绒毛相关miRNAs的表达规律：在一个绒毛周期内, 除let-7a外, miR-203、miR-205、miR-96、miR-183和miR-199a的表达量均发生3次跃迁;埋植MT改变了miRNAs之间的共表达模式。对照组各miRNA之间相关系数范围为0.87~0.99(P<0.01)。与对照组相比, 埋植组中let-7a与miR-96、miR-199a、miR-205, miR-203与miR-96、miR-199a, miR-96与miR-183, miR-183与miR-199a之间的相关系数被明显消弱;MT通过下调6月份埋植组各miRNA的表达量提早诱发二次生绒。     

肿瘤发生过程中miRNA与lncRNA的相互作用

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是生物体内普遍存在,且对生命活动具有重要调控作用的生物分子.以微RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long non coding RNA,lncRNA）为代表的ncRNA分子在肿瘤发生和发展过程中都有重要的作用.越来越多研究发现,miRNA和lncRNA之间的关系是非常密切的,某些lncRNA(如H19和BIC)可以作为miRNA的前体,通过加工成miRNA而发挥作用.有些miRNA通过作用于lncRNA影响肿瘤的发生(如：miR-129与MEG3,let-7与H19);同样地,有些lncRNA通过作用于miRNA影响肿瘤的发生(如：HULC与miR-372,PTCSC3与miR-574-5p,ciRS-7与miR-7,Sry与miR-138).miRNA与lncRNA之间既可以直接相互作用,也可以通过其它分子（特别是蛋白质或蛋白质复合物）间接地影响着肿瘤的发生和发展.揭示miRNA和lncRNA相互作用在肿瘤发生中的作用可以为肿瘤的诊断和治疗提供新思路.     

阿尔巴斯白绒山羊KAP6家族cDNA的特征分析

在构建内蒙古阿尔巴斯白绒山羊次级毛囊兴盛期皮肤组织cDNA文库的基础上,随机挑取636个克隆从5’端开始测序,对序列进行特征分析。分析结果表明有41个ESTs与绵羊KAP6-1基因同源性大于95％,且期望值小于1e-10,进一步分析可被分为6个Qusters。从每个Cluster中挑取一个全长cDNA序列,其核苷酸序列和预测编码的蛋白质序列表明AY310753与绵羊KAP6-1最为相似、AY310750差别最大,AY310751和AY310752在编码区分别缺少36个的核苷酸或12个的氨基酸。     

12个物种miR-302基因簇的生物信息学分析

很多microRNA (miRNA)基因在基因组上聚集排列形成miRNA基因簇.miRNA基因簇在进化上较为保守,有其特殊的生物学意义.miR-302基因簇在胚胎干细胞中特异表达,对胚胎干细胞的自我更新和多潜能维持有重要的作用.本文采用miRBase数据库查询和BLAST同源搜索方法共搜寻并分析了12个物种的miR-302基因簇.生物信息学分析表明,这些物种miR-302基因簇均位于LARP7蛋白基因的内含子区,但转录方向与LARP7基因转录方向相反.序列相似性分析显示,同一物种miR-302簇成员间以及不同物种相应miR-302簇成员间相似性均较高.进化分析表明,基因复制可能是miR-302基因簇进化的主要驱动力.     

应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达

microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA, 主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译, 在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关, 但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察miRNA动态表达的方法。文章以斑马鱼为模式, 建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer), 用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定miRNA的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2转座子为基础, 采用来自斑马鱼hsp70基因的热激启动子分别驱动eGFP和mRFP1荧光报告基因, 同时在其中一个报告基因的3′-UTR区连接待测miRNA的互补序列, 构成Tracer质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减弱, 通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA的表达区域, 检测斑马鱼胚胎中miRNA起作用的位置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的miR-206以及在神经系统特异表达的miR-219, 分别在显微注射瞬时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer系统。结果表明, 所用的方法能够如实地在单细胞水平和整体水平检测到目标miRNA的时空表达动态变化。miRNA Tracer系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法, 也为对miRNA进行功能与作用机制等更深入的研究奠定了基础。

补充资料

s219mRFP1-dF转基因胚胎的3-D图像 [视频]     

miRNA-9基因家族进化分析及其靶基因预测

microRNAs(miRNA)是真核生物中一类长度约为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA,在转录后水平调控基因的表达。该文在miRBase中搜索后生动物的mir-9基因序列。47个物种中共搜索到120条mir-9基因序列,说明mir-9基因家族广泛存在于不同物种中。基因定位显示86%的mir-9基因存在于基因间隔区(IGR),多序列比对发现miR-9基因家族成熟序列的第2位到第8位碱基以及第14位到第18位碱基为保守碱基。进化分析表明mir-9b和mir-9c可能是此基因家族最早出现的基因形式,即祖先基因。这些祖先基因经过串联重复、大片段重复、个别碱基的缺失及突变等方式形成了脊椎动物中miR-9-1至miR-9-7数个基因。分别采用四个miRNA靶基因预测软件对mmu-miR-9的靶基因进行预测,发现miR-9与神经系统发育、心肌系统疾病和跨膜运输系统等密切相关。该研究为今后进一步研究miRNA调控的神经系统发生和神经细胞生长与分化的机制奠定了基础。     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

高糖诱导内皮细胞损伤microRNA表达紊乱的体外研究

目的:研究高糖诱导的内皮细胞损伤微小RNA(microRNA,miRNA)的表达变化。方法:常规培养的人冠状动脉内皮细胞,利用不同浓度D-葡萄糖溶液(0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和25 mmol/L),诱导刺激24 h后分别用CCK-8法和流式细胞术检测其生长活力和凋亡水平。收集细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测miRNA的表达变化,同时利用TargetScan、PicTar等生物信息学预测软件预测可能的靶基因。结果:高糖溶液(25 mmol/L)刺激内皮细胞后,细胞生长活力明显降低,为对照组的67.5%(P0.01),凋亡水平为对照组的4.5倍(P0.01)。QRT-PCR结果显示miRNA的表达出现了明显的紊乱,其中miR-451、miR-504、miR-302d、miR-18b*、miR-198、miR-328和miR-517c明显下调,miR-29c、miR-100*、miR-137、miR-660和miR-217明显上调(P0.05)。靶基因预测发现miR-217和miR-451可能调控内皮细胞功能相关的多个基因的表达。结论:在高糖诱导的内皮细胞损伤中,miRNA表达紊乱提示其可能参与内皮细胞功能。     

MiR-203 及其调控机制的研究进展

MicroRNA(miRNA)是一种长18-25个碱基的单链非编码RNA,其广泛参与机体众多病理、生理过程。MiR-203是一种上皮组织特异性表达的miRNA。研究发现miR-203在皮肤发育、皮肤相关疾病、上皮组织肿瘤等病理、生理过程中发挥重要调控作用。一些疾病的研究还发现了miR-203与表观遗传学机制的相互作用,而miR-203调控机制的研究集中在P63、SOCS-3及相关的信号通路等方面。     

miR-106-363基因簇在脊椎动物中的进化分析

microRNA(miRNA)是一类在真核生物体内广泛表达的非编码小分子RNA,在生物体生长、发育以及疾病发生等过程中都起着极其重要的作用。miR-106-363基因簇是一个高度保守的基因簇,编码miR-106、miR-18、miR-20、miR-19、miR-92和miR-363等6个miRNA。本文通过对miRBase数据库检索以及同源搜索的方法在16种脊椎动物中搜索到了miR-106-363基因簇。该miRNA基因簇在高等脊椎动物中高度保守,稳定存在。系统进化树分析表明,miR-106-363基因簇与miR-17-92基因簇有着共同的祖先,且在进化上miR-17-92基因簇有着更早的起源。     

miR-21在头颈肿瘤中的研究进展

微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类小分子非编码RNA,可引起靶m RNA的降解或翻译抑制,从而对基因进行转录后表达调控,它在细胞生长、发育和衰老等生命过程中扮演着重要角色。miR-21在人类组织和细胞中较早发现,是广泛存在的miRNA之一,也是实体肿瘤中最常见的过高表达miRNA之一,在肿瘤的发生发展中可能发挥癌基因的作用。该文就miR-21在头颈肿瘤中的研究作一综述。     

针对miR-221 基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的 筛选与检测

目的:构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法:合成含干扰序列的双链DNAoligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用westernbolt法检测其有效敲减靶序列。结果:重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果最好。结论:本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。     

病毒编码的miRNA:基因表达新的调控因子

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的RNA,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前,通过生物信息学手段和分子克隆方法,已发现了3518种miRNA,在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现疱疹病毒、多瘤病毒、逆转录病毒的某些病毒基因组也能够编码miRNA,这些miRNA在调控病毒基因自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起重要的作用。某些病毒甚至能够利用宿主体内的miRNA调控其自身表达。找出病毒可能编码的miRNA,探索其对病毒感染、复制、表达的作用,有助于病毒分子生物学的研究,也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。