水稻Rac家族新成员osRACB基因的克隆及结构分析

Rac基因是植物中惟一的一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 它在整个植物生长发育过程中起着极为重要的作用. 应用本实验室已有的水稻光周期育性转换相关基因osRACD为探针, 在低严谨杂交条件下, 筛选农垦58N-LD雌雄蕊形成期(第Ⅳ期)幼穗cDNA文库, 获得一水稻Rac家族新基因. 经同源性比较和序列分析显示, 该基因与玉米Rac家族成员RACB基因具有93%的核苷酸同源性, 且两者氨基酸序列长度相等, 仅存在一个氨基酸残基差异, 故命名新基因为osRACD. 进一步应用PCR技术, 以农垦58N基因组DNA为模板扩增得到长度为2930 bp的osRACB基因转录区核苷酸序列, 其结构包含7个外显子和6个内含子, 同时, 通过基因组文库筛选获得osRACB基因的启动区序列. Southern杂交分析表明osRACB基因同其他Rac基因相似, 是低拷贝基因. RT-PCR检测显示osRACB基因在水稻根、茎、叶中均有一定的表达, 但在茎中表达量最高. 此外, 还以人Rac1蛋白为模板, 利用InsightII软件包下的Homology, Discover等模块对osRACB蛋白进行了三级结构预测.     

amrG1基因在谷氨酸棒杆菌乙酸活化中的作用

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum可以利用乙酸为碳源和能源进行生长. 乙酸代谢中涉及乙酸活化的两个酶为磷酸转乙酰酶PTA和乙酸激酶AK, 它们是由pta-ack操纵子经诱导表达产生的. 采用转座子挽救法, 我们从调控突变株C. glutamicum G25中获得了amrG1和amrG2两个目标基因. 经分析鉴定, amrG1基因(NCBI GenBank 接受号为AF532964)可能参与乙酸代谢调控, 编码作用于pta-ack操纵子的一个调控因子. 该调控因子基因序列全长732 bp, 开放阅读框含有243个氨基酸, 分子量约为27 kD. 通过基因定点缺失和过量表达技术, 在谷氨酸棒杆菌野生型菌株中分别构建了amrG1基因缺失菌株和表达菌株, 并研究了它们在含有葡萄糖和/或乙酸不同碳源的基本培养基上生长时产生的PTA和AK酶活性特征. 酶活性测定结果发现其中的amrG1基因缺失菌株和表达菌株存在着与野生型菌株不同的一系列酶学特征, 分析显示: 以野生型菌株为对照, amrG1基因缺失菌株在含有葡萄糖碳源的培养基上生长时表现出较高的PTA和AK酶活性, 并且在葡萄糖和乙酸两种碳源上生长时表现出与乙酸碳源上生长时几乎同样的PTA和AK酶活性; amrG1基因过量表达对葡萄糖碳源上生长产生的PTA和AK酶活性有一定程度的抑制, 即表现出与基因缺失情况相反的调控效应. 根据以上结果分析, amrG1可能编码了作用于pta-ack操纵子的一个阻遏因子或共阻遏因子.     

棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用, 而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用. 从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA, 并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析. GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域, 其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似. 采用Ni-NTA亲和层析技术, 成功纯化了在BL21 (DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区. 凝胶滞留实验揭示, 纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区, ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEA D113启动子区中的类DRE元件(核心区, GCCGAC)结合. 半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导. 这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合, 在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.     

L-乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D ,L_乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ14 4作为宿主 ,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因 (ldhL)。核酸序列分析表明 ,该基因以ATG为起始密码子编码 316个氨基酸残基组成的蛋白质 ,预测的分子量为 33 84kD ;5′端存在典型的启动子结构 ,3′端的终止子是不依赖于 ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有 3个保守区域 ,其中Gly13～Asp50保守区域是NADH的结合位点 ,Asp73～Ile10 0和Asn12.3～Arg15.4保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核苷酸序列相似性最高仅为 64.1% ,氨基酸序列相似性最高仅为 68.9% ,是新的L_乳酸脱氢酶基因     

水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能

利用PCR方法从水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv. oryzae和pv. oryzicola)的12个菌株中, 扩增出了编码诱导植物过敏反应蛋白激发子Harpin的3类hrfA (hypersensitive response functioning factor A)同源基因hrf1, hrf2和hrf3. 同源性分析表明, 这些同源基因推测的编码产物均富含甘氨酸, 缺乏酪氨酸, 在序列的第45位附近的氨基酸都有一个半胱氨酸. Harpin_Xoo由来源于水稻白叶枯病菌的hrfA基因编码, 产物包括两类, 一类代表菌株为JxoⅢ, 其中GGG-GG基序的重复数为3个, 分子量为15.6 kD; 另一类代表菌株为Pxo112, 产物中GGG-GG基序的重复数为4个, 分子量为15.9 kD, 这两个基因分别命名为hrf1和hrf3. Harpin_Xooc由来源于水稻条斑病细菌的hrfA基因编码, 代表菌株为RS105, 其中GGG-GG重复数为2个, 分子量为15.3 kD, 水稻黄单胞菌Harpin分子中的一个半胱氨酸残基是其特有的. 将这3类基因与已报道的hpa1和xop1基因编码的氨基酸序列进行聚类分析, 结果可以将其分为4类, 来源于水稻黄单胞菌的Harpin_Xoo和Harpin_Xooc被分在相邻的两类中. 对3种产物进行比较研究结果, 在相同条件下3个代表菌株JxoⅢ, RS105和Pxo112的hrfA基因(hrf1, hrf2和hrf3)表达蛋白的相对浓度分别为: 0.389, 0.530, 0.083 mg/mL. hrf1, hrf2和hrf3在大肠杆菌(Bl21)中的表达产物(Harpins)在烟草上均能激发过敏反应和诱导抗病性, 其生物活性依次为Hrf2, Hrf1和Hrf3.     

水稻bZIP蛋白REB结合Wx基因启动子中的GCN4基序

在水稻Wx基因启动子中找到了一个由胚乳基序(EM)和GCN4基序组成的双元胚乳盒. 许多文献报道,种子贮存蛋白基因启动子中的胚乳盒与基因的种子专一性表达有关,一类bZIP家族的转录因子通过结合胚乳盒中的GCN4基序而调控相应基因在种子中专一性表达.本文证明了水稻Wx基因启动子的胚乳盒中的GCN4基序能被水稻未成熟种子中的核蛋白识别并结合.进一步采用PCR的方法克隆了水稻bZIP家族的转录因子——REB的部分cDNA,并在E.coli中表达了REB融合蛋白.凝胶滞后试验结果表明,除文献报道,REB能结合α-globulin启动子上的靶位点外,REB也能识别并结合水稻Wx基因启动子的GCN4基序.     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

哺乳动物Bax基因在长春花细胞中的诱导表达及其对长春花生物碱合成的促进作用

Bax是哺乳动物细胞凋亡基因Bcl-2家族中的一员. 以往的研究报道表明, Bax基因可以诱发拟南芥等模式植物的超敏反应 (hypersensitive reactions, HR). 为了考查Bax基因对药用植物细胞次生代谢产物合成的影响, 我们构建了长春花雌二醇诱导型Bax基因工程细胞系. 实验结果表明, 转基因长春花细胞中Bax基因的表达水平对β-雌二醇浓度呈现明显的依赖性, 说明雌二醇诱导型启动子可以有效控制转基因长春花细胞中Bax基因的表达. 在30 μmol/L β-雌二醇处理下, 转基因长春花细胞中的长春花碱和总生物碱含量分别比野生型细胞高5. 0和5. 5倍, 表明哺乳动物Bax基因对长春花细胞中生物碱的合成具有促进作用. Northern blotting和Western blotting检测结果表明, Bax基因可以提高转基因长春花细胞中萜类吲哚碱生物合成途径关键酶基因Tdc和Str的转录水平, 并且促进细胞中防御相关蛋白PR1的积累, 说明Bax基因可以诱发长春花细胞的防御反应, 激活细胞中萜类吲哚碱生物合成途径, 从而提高长春花生物碱的合成代谢流量. 研究结果表明, 哺乳动物Bax基因可以从细胞水平上促进植物次生产物的合成, 为植物细胞次生代谢产物合成的分子调控提供了一种新的策略.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

人类组织特异性DNA聚合酶POLλ2基因的克隆、表达纯化和鉴定

发现并克隆了一个肝脏特异的人类DNA聚合酶基因, 是POLλ的一个剪接体, 命名为POLλ2. 该剪接本的cDNA长2206 bp, 包含一个1452 bp的开放阅读框, 编码482个氨基酸, 位于人10号染色体长臂24区, 长约7.9 kb, 包含8个外显子和7个内含子. 生物信息学分析表明, POLλ2蛋白和DNA聚合酶X家族成员高度同源, 并含有这个家族特有结构域POLx, 因此是一个DNA聚合酶X家族的新成员. 该剪接本的核苷酸序列和相应蛋白质氨基酸序列已提交至GenBank, 登录号为AY302442. 亚细胞定位实验证实, POLl2蛋白定位于细胞核; 人16种组织表达谱实验表明, POLl2在肝组织和睾丸组织中特异性高表达, 在卵巢组织中低表达, 而在其他组织中没有检测到表达. 癌和癌旁表达实验表明, 与正常肝组织和癌旁组织相比, 在15个肝癌组织的样本中有80%样本的POLλ上调表达, 导致POLλ2 和POLλ的mRNA分子的比例异常, 可能和肝癌的病理过程有关. 通过筛选菌株, E.coli BL21(DE3)CONDON Plus可以高效地表达可溶性POLλ2蛋白; 通过Ni-NTA resin 和Superdex-75纯化了POLλ2重组蛋白. 经过同位素α-32P-dCTP掺入实验, 证实了POLλ2具有DNA聚合酶活性.     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.     

TFAR19基因对小鼠红白血病MEL细胞生长及其流变学特性的影响

通过脂质体介导基因转染的方法, 获得了稳定携带TFAR19基因的小鼠红白血病细胞系MEL-TF19. 经Western blot证实该细胞系有TFAR19蛋白表达. 生长曲线及流式细胞仪检测结果表明, 转染TFAR19基因后MEL细胞生长受到抑制, 并且在凋亡诱因的存在下使细胞凋亡率增高. 流变学研究结果显示, 转染TFAR19基因在加速MEL细胞凋亡的同时, 使细胞对低渗的抵抗力降低, 渗透脆性加大, 细胞表面电荷减少, 电泳率降低; 与细胞最大变形能力呈负相关的弹性模量K₁增加, K₂无明显变化, μ 明显减小. 以上结论从生物流变学角度为全面、深入地认识凋亡新相关基因TFAR19的功能提供了理论基础.     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的TFO设计、体外三链形成及功能的检测

血小板衍生生长因子(PDGF)在肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等病理状态中起着极其重要的作用,其B链基因为原癌基因c-sis的同源物.提供了用于抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的3种TFO(三链形成寡聚脱氧核苷酸triplex-forming oligonucleotide).凝胶阻滞电泳、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制及核蛋白结合抑制等实验证明了这些化合物可与靶位点(c-sis/PDGF-B基因5′上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物,并可抑制其下游基因的转录和转录因子的结合.它们有望应用于配制治疗肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物.     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR 克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHAR dehydroascorbate reductase 基因的 cDNA 与 DNA 全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导 PCR 的染色体步行技术（genome walking）克隆了其上游 644bp 的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长 1486bp,存在两个内含子,DNA 编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明：BoDHAR与同源基因AT1G195701cDNA 序列有 82.3% 的一致性,推导的氨基酸序列有 79.6% 的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明：BoDHAR 在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

来源于Aspergillus candidus的乳糖酶基因的克隆及序列分析

从一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列(EMBL ACCESSION No. AJ431643),序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3458bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长3015bp,共编码1005个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽序列,氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因与不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现,该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC 20423的乳糖酶序列同源性较高,但其在酶学性质上更优于后者,亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。 