听毛细胞钙信号转导及其与细胞能动性的关系

应用激光扫描共聚焦显微镜和ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ双重荧光标记法,研究豚鼠耳蜗分离外毛细胞钙信号转导及其与细胞能动性的关系。外毛细胞（ｏｕｔｅｒｈａｉｒｃｅｌ,ＯＨＣ）受药物或机械刺激后,其钙信号起源于一侧质膜,可形成钙波传向全细胞,对其中１个ＯＨＣ测得传播速度为０．０２５－０．０４７μｍ／ｓ。钙信号转导过程中各亚细胞区域游离钙浓度增加幅度不同。胞内游离钙增高时伴有细胞长度变化,缩短者占６／１０,伸长者占４／１０。对照组（不予刺激且胞内游离钙无变化者）３个外毛细胞中,缩短者２个,长度无变化者１个。实验表明,听毛细胞受刺激后可产生钙波,钙信号具有不均匀性,外毛细胞的钙依赖慢运动表现为细胞伸长,细胞缩短则在胞内游离钙浓度升高或保持于静态基准浓度时均可发生。     

丁胺卡那霉素对耳蜗外毛细胞运动及胞内游离钙的影响

本文运用连续录像手段和荧光测钙技术研究丁胺卡那霉素对离体耳蜗外毛细胞运动及胞内游离钙浓度的影响。结果显示：（１）正常状态下外毛细胞内游离钙的荧光比值为１．３９±０．０９（ｘ±ｓｘ,ｎ＝１５）;从等渗环境进入低渗环境外毛细胞变短变粗（Ｐ＜０．０５,ｎ＝７。（２）丁胺卡那霉素（６．６７ｍｇ／ｍｌ）可使外毛细胞胞膜皱缩内陷,局部直径明显变细（Ｐ＜０．０１,ｎ＝１９）,即使在低渗环境中也难以恢复原状。（３）丁胺卡那霉素（３．２３ｍｇ／ｍｌ）可瞬间降低细胞内钙离子浓度,使荧光比值降低１４．６８±２．０５％（Ｐ＜０．０１,ｎ＝１２）。提示丁胺卡那霉素的耳毒性作用机制可能通过降低细胞内游离钙浓度,进而影响外毛细胞钙依赖性的“慢能动性”运动     

豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞及外指细胞钙成像

用ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ荧光比值作细胞内游离钙指标,用激光扫描共聚焦显微镜测定豚鼠耳蜗分离的内、外毛细胞及外指细胞的游离钙,并利用钙成像技术进行细胞形态计量。单个外毛细胞呈试管状。内毛细胞呈烧瓶状,有明显的颈部。外指细胞分为体部及指状突部。毛细胞的胞内游离钙浓度明显高于外指细胞。毛细胞的胞质、胞核及表皮板的游离钙浓度不同。外指细胞的细胞体与指状突的游离钙浓度也不同。本研究认为,有无颈部为区别分离的内、外毛细胞的重要标准,外指细胞可凭借其特异的指状突结构以资识别。内耳毛细胞及外指细胞胞内游离钙分布的不均一性可能与各部位生理功能不同有关。     

豚鼠球囊毛细胞的分离及钾离子流的研究

目的：研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法：用酶深化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞,并用全细胞膜片钳观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上的钾通道电流。结果：①胶原酶Ⅳ浓度为０．３５ｍｇ／ｍｌ时,分离的毛细胞数量最多,存活时间最长;②当钳制电位为－１００ｍＶ,以１０ｍＶ的步距,从－７０ｍＶ至＋２０ｍＶ阶跃,随着膜 电位的去极化,可记录到一系列快速、瞬时的以Ａ型钾通道为主的外向电流,４－Ａｐ对其有特异     

SNP抑制5-HT诱导的胞内游离钙浓度升高和内钙释放

用Ｆｕｒａ － ２／ＡＭ 荧光测量技术研究了５ － 羟色胺（５－ ＨＴ） 诱导的大鼠尾动脉平滑肌细胞胞内钙升高和一氧化氮（ＮＯ） 的抑制效应。实验表明, 胞外０ｍ ｍｏｌ／ Ｌ Ｃａ２ ＋ 时胞内静息［Ｃａ２ ＋ ］ ｉ 为２０ ．２±８ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ８） 。１０μｍｏｌ／Ｌ ５－ ＨＴ 可诱导出胞内钙库释放引起的瞬态［Ｃａ２ ＋］ｉ 升高,其峰值达２４５ ．７ ±７１．６ｎｍｏｌ／ Ｌ（ｎ ＝ ６） 。１０ － ７ ｍｏｌ／Ｌ 硝普钠（ＳＮＰ） 可抑制５－ ＨＴ 诱导的［Ｃａ２ ＋］ｉ 升高,其峰值浓度降为７５．１±３５ ．９ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ５） 。当细胞浴液含２．５ｍ ｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２ ＋ 时,静息［Ｃａ２ ＋］ｉ为１１２ ．８ ±１０ ．３ｎｍｏｌ／ Ｌ（ｎ ＝ ５） , 这时１０μｍｏｌ／ Ｌ ５ － ＨＴ 可诱导［Ｃａ２ ＋ ］ ｉ 的峰值为２５２ ．３ ±８０ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ４） ,以及其后平台浓度为１４３ ．０ ±３７ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ４） ,略大于［Ｃａ２ ＋］ｉ 为１１２．８ ±１０ ．３ｎｍｏｌ／Ｌ 的静息浓度,为外钙内流引起。１０ － ７ ｍｏｌ／Ｌ ＳＮＰ 也可抑制５－ ＨＴ 诱导［Ｃａ２ ＋ ］ｉ 平台相浓度。平台浓度由１４３ ±４７     

豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性

本文旨在探讨豚鼠I型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究。应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠I型前庭毛细胞对乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的反应。结果显示,7．5％（21／279）的I型前庭毛细胞对10-1000μmol／L ACh敏感,引发明显的外向电流。该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度（EC50）为（63.78±2．31）μmol／L,但该电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol／L ACh激活-持久缓慢的外向电流,电流幅值为（170±15）pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断。I型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min。长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。以上结果提示,部分豚鼠I型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活-持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性。本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示I型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义。     

外源性神经节苷脂对人－肝癌培养细胞内钙的作用及其方式

本工作采用荧光探针Ｆｕｒａ－２ＡＭ观察了外源性神经节苷脂ＧＭ３和ＧＤ３对ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌培养细胞钙的影响,证明ＧＭ３和ＧＤ３均能升高细胞内钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）,但程度上有极大差异。１０ｎｍｏｌ／ｍＬＧＭ３或１．０ｎｍｏｌ／ｍＬＧＤ３可使［Ｃａ２＋］ｉ上升高是明显,与对照相比［Ｃａ２＋］ｉ分别增加２１５～２５０％和４２％。进一步用Ｖｅｒａｐａｍｉｌ阻断钙通道和内质网钙释放、去除细胞外Ｎａ＋以抑制Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换以及去除细胞外Ｃａ２＋在无外钙内流等系统观察了ＧＭ３和ＧＤ３的作用方式,结果提示ＧＭ３升高［Ｃａ２＋］ｉ的机制是一个同时增加内质网钙释放、激活钙通道并伴有质膜Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶激活的综合结果;而ＧＤ３则主要抑制Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换系统。     

庆大霉素对豚鼠耳蜗一氧化氮合酶活性的影响

目的：研究庆大霉素（ＧＭ） 致聋豚鼠耳蜗一氧化氮合酶（ＮＯＳ） 的分布及其变化,探讨一氧化氮（ＮＯ） 与ＧＭ 耳毒机制的关系。方法：ＮＡＤＰＨｄ 酶组化方法及显微图像分析技术。结果：ＧＭ 致聋后,ＮＯＳ 阳性反应物密度在血管纹、内毛细胞、外毛细胞、螺旋神经节、听神经纤维的分布均比对照组明显增高（ Ｐ＜ ０ ．００１）;上述部位的ＮＯＳ平均灰度值降低与对照组相比有显著差异（ Ｐ＜ ０ ．００１）;ＡＢＲ 听阈变化与ＮＯＳ平均密度及灰度值变化高度相关（ 上述各部位ｒ 值范围,ｒ密度听阈：０ ．９１４０～０．８６９８;ｒ灰度听阈：－０ ．７８９２ ～－ ０．９３４７;Ｐ＜ ０．０１）。结论：①ＮＯ 可能与ＧＭ的耳毒作用机制有关,是耳毒作用的重要因素之一;②ＧＭ 耳毒作用部位不仅发生在血管纹和外毛细胞,而且还涉及到内毛细胞、螺旋神经节及听神经纤维     

豚鼠耳蜗外毛细胞的急性分离及钾离子通道的研究

本文对豚鼠耳蜗离体外毛细胞的细胞活性及底侧膜处电压依赖性钾离子通道进行了研究,结果表明：（１）离体外毛细胞悬液保存在４℃时,可延长存活时间达７ｈ以上。（２）外毛细胞的静息电位：应用电流钳方法,在刚形成全细胞方式时其细胞内静息电位为－７３．７±６．９ｍＶ,２ｍｉｎ后为－９４．８±４．１ｍＶ（ｘ±ｓ,ｎ＝１０）。（３）全细胞方式记录到的电压依赖性外向Ｋ＋电流是由快钾电流和延迟整流钾电流两部分组成,快钾电流的激活电位为－６０～－５０ｍＶ,延迟整流钾电流的激活电位为－４０～－３０ｍＶ,电流－电压关系曲线呈“Ｓ形上升”趋势。外向Ｋ＋电流被ＴＥＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）阻断后,可观察到一种电压依赖性内向电流     

云南红豆杉愈伤组织诱导和组织培养

云南红豆杉愈伤组织的诱导频率为Ｗｈｉｔｅ〉ＭＳ〉Ｂ５,其中最高达８０％,叶片和种子之间差异不大,但不同时期的叶片差异较大,以嫩叶诱导为佳,激素配比以２,４－Ｄ２．０－３．０ｍｇ／Ｌ,ＢＡＰ０．５－１．０ｍｇ／Ｌ为宜,在继代培养阶段,Ｂ５比Ｗｈｉｔｅ和ＭＳ更适合细胞的快速生长、繁殖,并且有利于克服组织的褐化,适合于细胞生长的激素配比也以２,４－Ｄ２．０－３．０ｍｇ／Ｌ,ＢＡＰ０．５－１．０ｍｇ／Ｌｏ