抗间日疟红内期原虫单克隆抗体识别和检测抗原分子量

检测分析间日疟红内期原虫特异性抗原组分,在间日疟的免疫诊断、抗原分离纯化等方面均具重要意义。作者已成功地制备了一批抗人间日疟红内期原虫单克隆抗体(McAbs),为进一步研究这些McAbs所识别的特异抗原分子,作者将间日疟红内期原虫抗原经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离,通过转移电泳(Westernblot)将凝胶中的抗原区带转至硝化纤维膜(NC—paper)上,用McAbs进行识别,检测所识别的靶抗原分子量,取得了满意的结果,现报道如下。材料和方法一、可溶性抗原的制备:自流行区采集间日疟患者静脉血,用Percoll分离出原虫,…     

完整弓形虫P35重组蛋白IgM-酶联免疫吸附测定法检测弓形虫急性感染

为利用重组的完整弓形虫表面抗原P35 GST蛋白对弓形虫感染进行血清学诊断 ,构建了可表达P35 GST的JM10 9细胞株 .采用亲和层析对融合蛋白进行分离和纯化 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblot)分析所表达的蛋白质 ,并用纯化的重组蛋白进行IgM 酶联免疫吸附测定法 (IgM ELISA)检测不同病人血清中的抗 P35抗体 .SDS PAGE分析发现P35 GST重组蛋白的大小约 6 0ku ,为一亲水性蛋白 ,蛋白质印迹分析表明该蛋白与弓形虫阳性感染病人的血清有特异性反应 .利用P35 GST为抗原 ,对 6 0例血清进行IgM ELISA分析 ,发现P35 GST可明显区分近期感染和既往感染 ,在弓形虫的诊断上有很大的应用前景 .     

19S调节复合体中亚基之间的相互关系

26Ｓ蛋白酶体是真核细胞内最主要的非溶酶体蛋白水解酶 ,它降解泛素化的底物蛋白质 ,在调节必需的胞内生命活动 (如细胞周期、抗原提呈、转录、信号转导 )中发挥着重要作用。 2 6Ｓ蛋白酶体是多亚基复合体 ,由两个亚复合体 2 0Ｓ降解核心和 19Ｓ调节复合体 (亦称ＰＡ70 0 )组成 (图 1) ,它们与在古细菌发现的蛋白酶体有高度的同源性[1] 。底物蛋白质与泛素单体结合后 ,被 2 6Ｓ蛋白酶体识别并进入到其内部的水解空间被降解。 2 0Ｓ颗粒是底物蛋白质的水解中心。 19Ｓ调节复合体 (19Ｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｍ ｐｌｅｘ ,以下简称 19ＳＲ…     

应用单克隆抗体鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白

对线粒体蛋白质组的鉴定和分析有助于理解线粒体的功能和相关疾病的发病机制, 包括能量代谢、凋亡、自由基产生、产热作用、钙离子信号通路等. 本实验旨在鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白. 用线粒体蛋白质作为免疫原, 经过细胞融合、筛选和克隆, 制备了240多个单克隆抗体杂交瘤细胞系. 单克隆抗体识别的线粒体蛋白抗原通过人类肝脏cDNA表达文库筛选方法鉴定, 相应的线粒体蛋白质的亚细胞定位通过免疫组化证实. 发现了肝脏线粒体中6个抗原优势蛋白, 分别被至少两种特异性的单克隆抗体所识别. 这6个蛋白分别是乙酰辅酶A酰基转移酶(线粒体3-酮酯酰辅酶A硫解酶)2、醛脱氢酶1家族A1、氨甲酰磷酸合成酶1、二氢硫辛酰胺S乙酰转移酶(丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分)、烯酰辅酶A水合酶1和羟基类固醇(11β)脱氢酶1. 这些单克隆抗体有望应用于人类肝脏蛋白质组计划的相关研究, 如去除优势蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用的研究和验证等.     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估     

免疫胶体金标记显示波形纤维与核孔复合体的结合

中间纤维与细胞核的关系是一个亟待解决的重要问题。本文采用火鸡红细胞作为研究材料,首先用细胞分级抽提结合免疫印迹反应显示火鸡红细胞中间纤维蛋白为波形纤维蛋白。然后,我们采用细胞分级抽提结合包埋前免疫胶体金标记的方法显示胞质中间纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金特异标记。同时,我们显示结合于核孔复合体上的胞质纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金所特异标记。本文结果表明,结合于核孔复合体上的胞质纤维是波形纤维,并且提示波形纤维可能通过与Nup 180的结合附着在核孔复合体上,为进一步探讨中间纤维与核孔运输的关系提供了初步实验证据。     

用固相放射免疫方法分析流行性乙型脑炎病毒抗原

用固相放射免疫方法对3株流行性乙型脑炎病毒(JEV)进行了抗原分析,其中日本分离的2株(中山予研株,Mie 44-1株),中国分离的1株(A_2株)。为了纯化抗原,先将3株病毒的小鼠免疫血清分别加入到聚脂纤维柱,进行免疫亲合层析,对照抗原同样处理。固相放射免疫测定是将纯化病毒抗原与对照抗原先用超声波(10kc30秒)处理,使之均质化。铁珠(直径为4.2mm)计数后,放入4单位抗原悬液中,4℃下作用60分钟,然后将抗原包被的铁珠加入稀释的小鼠抗血清中,4℃下作用60分钟,用磁性     

生物滤塔体系好氧反硝化菌的分离鉴定与特性研究

从实验室生物滤塔填料的生物膜上,经选择性培养基筛选,分离出4株好氧反硝化茵.好氧状态下4种菌的40h反硝化率均大于80%,其中菌种A1反硝化率可达到99.05%.跟踪菌种反硝化过程中氮元素24h变化过程,发现4株菌除A1外都有亚硝酸根积累.茵种A1为短杆菌,革兰氏阴性.生理生化特性研究与16S rDNA序列测定(GenBank接受号DQ836052.1)初步判定菌种A1为假单胞菌Pseudomonas putida.适于茵Al生长的初始pH值是7.0左右,温度30℃左右,当DO大于2.0mg/L时,DO的变化对菌种Al的反硝化效果影响很小.     

固定化蛋白质A在流动注射荧光免疫分析中的应用

利用蛋白质A在近中性pH条件下,能够与大多数哺乳动物抗体的Fc部分结合;在低pH条件下,又能将抗体洗脱下来的特性,以一蛋白质A固相免疫反应器,分离与抗体结合及未结合的抗原.并结合流动注射进样方便的特点建立了一个快速、简便并易于自动化的流动注射荧光免疫分析方法.研究了各种实验变量对测定的影响,并用于人体转铁蛋白的测定．     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Mn-SOD与抗癌胚抗原(CEA)单链抗体基因(ScFv gene)融合,重组到含T7启动子的表达载体pET-22b(+)中,构建表达质粒pETMnSOD-ScFv,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的24%。SDSPAGE和蛋白质印迹图谱显示表达物分子量为45kD与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为分泌型表达有利于纯化。RIA测定表明表达产物能特异性的与抗原CEA结合,同时邻苯三酚法测定也表明表达产物具有SOD酶的活性,该融合蛋白为分泌CEA肿瘤的靶向性治疗提供新的途径。     

使用固定于硝酸纤维膜上的抗原筛选单克隆抗体的两种方法

<正>近年来免疫化学和放射性免疫的许多工作已经涉及到固定于硝酸纤维膜上抗原的应用。Haukes等人的点一免疫结合试验用微量抗原结合硝酸纤维膜上为筛选单克隆抗体(McAb)提供了一个方案。我们发展了一种简化了的筛选体系,即把抗原点加在一张与96孔微量滴定板同样大小的硝酸纤维膜上,用一块制成单园孔的铝模板置于有抗原点的硝酸纤维膜上面,可加入极少量(2ul)的杂交瘤上清液亦可与大量(可达200ul)杂交     

液质联用技术分析比较基因重组卡介苗与传统卡介苗Ag85复合体成分

目的利用液质联用技术分析比较基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗的主要分泌型抗原Ag85复合体成分。方法分别提取基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清中的分泌蛋白,采用反相高效液相色谱(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)进行分离,并将最终得到的目的蛋白峰采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS ReflexⅢ)进行质谱分析鉴定。结果基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清分泌蛋白Ag85复合体成分有所不同,Aeras-422表达的Ag85复合体成分包括Ag85A和Ag85B两种抗原,传统卡介苗菌株仅分泌表达Ag85A抗原。结论基因重组卡介苗Aeras-422分泌Ag85复合体的能力优于传统卡介苗。为建立新型结核病疫苗的质控方法提供了数据支持。     

细胞工程

8 90742兽医诊断中单克隆抗体的应用一分泌单克隆抗体的杂文套的组珍〔会,法〕/Coppe,P.泌A红红.Med.Vet一19‘88,132(3)一243~250〔译自DBA.1988,7(16),88一08124」. 虽然代价比较昂贵,免疫荧光仍然是兽医诊断‘扣的一个重要工具。如果将荧光染料结合到单克隆抗体中,那么通过镜检就能观察到抗体及其所连接的组织。单克隆抗体可通过用纯化抗原免疫小鼠或大鼠而产生。然后用聚乙二醇(PEG)使鼠的B一淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,再将所产生的杂种细胞培养在HAT选择培养基中。然后便可获得产生单克隆抗体的杂交瘤,可以将它住人适当的动物中…     

SARS 冠状病毒 S 蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图

严重急性呼吸综合征 (SARS) 是一种新出现的人类传染病,该病的病原是 SARS 冠状病毒 (SARS-CoV). S 蛋白是 SARS 冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用 . 研究表明 S 蛋白与受体结合的核心区域为第 318 ~ 510 氨基酸残基的片段 . 首先克隆并用 pGEX-6p-1 载体融合表达了该受体结合结构域,并且通过蛋白质印迹分析表明,该受体结合结构域融合蛋白能被 SARS 康复患者血清和 S 蛋白特异的单克隆抗体所识别 . 为了对这一区域进行抗原表位作图,进一步设计了一套 23 个覆盖受体结合结构域的长 16 个氨基酸残基的部分重叠短肽,并进行了 GST 融合表达 . 用免疫动物血清和单克隆抗体 D3D1 对 23 个融合蛋白进行蛋白质印迹和 ELISA 免疫反应性分析,结果鉴定出两个抗原表位 SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349) 和表位 D3D1 (K447LRPFERDI455). 其结果对进一步分析 S 蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有一定意义 .     

编码口蹄疫病毒结构蛋白的cDNA的核苷酸序列

作者测定了编码口蹄疫病毒(FMDV) (A1061品系)外壳结构多肽的cDNA全核苷酸序列,同时也测定了其两侧的编码非结构蛋白P20a和P52的部分核苷酸序列。VP1VP2和VP3三种较大未修饰的结构蛋白分子量大小分别为23248,24649和24213,较小的VP4只能粗略估计为7360,因为其5’-端编码区尚未确定。将VP1(主要的免疫抗原)和P52的N-端1/4的序列与Kurz等(Nucl.Acids Res.9(1981)1919-1931对另一血清型(O_1K)所得数据进行比较发现,编码VP1区段中的差异要比编码P52的区段中的差异大得多。这反映了这两种蛋白质氨基酸序列水平上的差异。相对密码子使用频率的分析表明,在第3位碱基上C和G的使用频率远大子U和A。二核苷酸频率A-C和C-A大于A-U和U-A。     

质粒研究与载体构建

922017含诱变白喉毒素A一链编码序列质一粒的构建和农达〔英」/F isher,K.S。…了Infeet.Immun一x991,69(20)一3562~3565〔译自DBA,1991,10(23),91一13322〕 用编码白喉棒杆菌(Co,鱿,e乙acte,￡“仍‘￡-尹hth。川““)白喉毒素一A链片段(DT一A)转染可杀死细胞。构建了含3种突变DT一A编码序列(用Asp、Ser或Gln置换Glu一145)的表达载体。突变毒素的体外ADP核糖基化活性降低到1/100~1/300。在用含虫荧光素酶报道基因质粒的HeLa和293细胞进行的共转染实验中测定了这些构建物的毒性。比较了3种新的DT一A突变质粒和含野生型DT一A的…     

高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理（英文）

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用.这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体.9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式.到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究.在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体.这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验.利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用.此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾.综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具.     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 的作用机制     

MHC-Ⅰ类肽组装复合体组分重要性的定量分析

TAP2、tapasin和calreticulin(CRT)是MHC-Ⅰ类内源性抗原加工和递呈途径肽组装复合体(PLC)中的3个重要蛋白质.虽然对于肽组装复合体及其单个蛋白组分在抗原加工递呈中的作用,国内外已有大量的研究,但是由于研究手段的缺乏,其在复合体中的相对重要性还未得到清楚和定量的分析.本文中我们建立了一种新型的抗原递送方法,利用猪链球菌溶血酶(SLY)对鼠纤维母细胞系K41及其CRT缺陷细胞系K42、tapasin缺陷细胞系90a及tapasin、TAP2双缺陷细胞系91a进行穿孔并定量递送入鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA),使其被内源性加工处理后的多肽SIINFEKL与小鼠H2-Kb装配成复合物并被递呈至细胞表面.通过利用小鼠T杂交瘤细胞B3Z和单克隆抗体25D1.16识别并检测不同细胞表面SIINFEKL与小鼠H2-Kb复合物,我们发现CRT缺陷细胞系K42的抗原提呈能力相比91a及90a,较K41有着更大幅度的下降,说明CRT在提呈过程中可能有着较预期更重要的作用.本文是首个对抗原递呈途径蛋白相对重要性的研究,其研究结果对于进一步研究MHC-Ⅰ类抗原加工和递呈途径相关蛋白的作用提供了理论依据与研究手段.     

小麦高分子量谷蛋白亚基专一性单克隆抗体的制备及其抗原决定簇的研究

以优异小麦品种“小偃6号”的高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)1Bx14和1By15为混合抗原, 免疫BALB/c小鼠. 将其脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)融合, 采用间接ELISA筛选与有限稀释法克隆, 建立了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系. 单抗Ig亚类为IgG1. 蛋白质免疫印迹实验结果表明: 该单抗能与小麦所有HMW-GS发生强烈反应, 而与醇溶蛋白和低分子量谷蛋白亚基不反应. 能与普通小麦近缘种粗山羊草、硬粒小麦、黑麦和大麦的高分子量贮藏蛋白发生反应; 而与燕麦、玉米、高粱、谷子和水稻等禾谷类作物贮藏蛋白不发生反应. 另外, 利用原核表达载体pGEX-4T-1, 将HMW-GS N端、中央重复区和C端3个结构域分别在E. coli BL21中融合表达. 免疫印迹实验结果表明, 该单抗识别的抗原决定簇应位于中央重复区中的六肽和九肽之中. 对该单抗的抗原决定簇及其在小麦品质育种中的运用进行了讨论.