重组腺病毒介导VEGF121 cDNA体外转移与表达

构建携带VEGF₁₂₁ cDNA重组复制缺陷型腺病毒表达载体,制备重组腺病毒,该腺病毒能介导VEGF₁₂₁ cDNA基因促进人脐静脉血管内皮细胞增殖,促进毛细血管管腔样结构形成.ELISA检测表明VEGF₁₂₁ cDNA基因表达产物分泌至培液上清,并显示强烈血管通透作用.为进一步利用重组腺病毒介导VEGF₁₂₁ cDNA进行缺血性疾病的基因治疗奠定良好的基础.     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

重组腺病毒介导VEGF121 cDNA体外转移与表达

构建携带VEGF12 1cDNA重组复制缺陷型腺病毒表达载体 ,制备重组腺病毒 ,该腺病毒能介导VEGF12 1cDNA基因促进人脐静脉血管内皮细胞增殖 ,促进毛细血管管腔样结构形成 .ELISA检测表明VEGF12 1cDNA基因表达产物分泌至培液上清 ,并显示强烈血管通透作用 .为进一步利用重组腺病毒介导VEGF12 1cDNA进行缺血性疾病的基因治疗奠定良好的基础     

人血管内皮细胞生长因子在毕赤酵母中的高效表达

血管内皮细胞生长因子 (Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃ ｔｏｒ,简称ＶＥＧＦ)是一类多功能细胞因子 ,特异地作用于血管内皮受体ＫＤＲ和Ｆｌｔ 1,促进新生血管形成并增加微血管的渗透性[1] 。ＶＥＧＦ在生理和病理 ,如肿瘤血管发生、伤口愈和、类风湿性关节炎、胚胎发育及冠心病等过程中起着非常重要的作用。天然ＶＥＧＦ是由两条糖蛋白链形成的二聚体。目前发现ＶＥＧＦ至少有 5种亚型 ,根据单体残基数不同分别为ＶＥＧＦ12 1,ＶＥＧＦ14 5,ＶＥＧＦ165,ＶＥＧＦ189和ＶＥＧＦ2 0 6,其中ＶＥＧＦ12 1和ＶＥＧ…     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

血管生成抑制因子K4K5 Cdna基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418－YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80％以上,产物浓度为150－250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮（BCE）细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成。     

尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽的cDNA克隆及真核表达载体的构建

Hepcidin是一类由动物肝脏细胞表达,具有调节铁代谢功能并具有抗菌作用的小分子阳离子抗菌肽,富含半胱氨酸,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。TH1-5属莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)3种Hepcidin cDNA序列中的一种。参考莫桑比克罗非鱼Hepcidin TH1-5的cDNA序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏Hepcidin全长cDNA为模板,通过PCR扩增到编码22个氨基酸的类似于TH1-5的尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽片段"mTH";通过设计含Xba I和Xho I酶切位点以及信号肽酶切位点的引物,将目的片段成功连接至pGAPZ-A真核表达载体,并转化进毕赤酵母菌GS115。经鉴定,重组真核表达载体"pGAPZ-A-mTH"已被成功构建,目的片段已整合进酵母染色体中。     

人血管内皮细胞生长抑制因子在巴斯德毕酵母中的分泌表达

血管内皮细胞生长抑制因子肿瘤部位新生血管的形成,切断肿瘤细胞营养供应及废物排泄通道,抑制肿瘤细胞恶性增殖。将编码成熟的人血管内皮细胞生长抑制因子基因克隆到表达载体pPICZα中,电转化P.pasto-ris GS115菌株,抗生素Zeocin^TM浓度梯度筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。经表型鉴定后,用甲醇进行诱导表达,SDS－PAGE和Western^TM浓度筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。经表表型鉴定后,用甲醇进行诱导表达,SDS－PAGE和Western印迹杂交结果证实了表达产物为重组人血管内皮细胞生长抑制因子-his6融合蛋白,表达量约为5mg/L。经细胞毒性试验测定,表达产物对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖具有较明显的抑制作用。     

Arresten在毕赤酵母中的表达和鉴定

Arresten来自人Ⅳ型胶原α-1链非胶原末端,可抑制新血管生成。从人肝脏提取总RNA,RT-PCR扩增arres-ten的cDNA,T载体进一步扩增后与表达载体pPIC9连接,测序,确认后转入毕赤酵母,获得表达可溶性arresten的酵母细胞。表达产物经初步纯化后,用SDS-PAGE测定分子量为26kD,与理论计算值接近;表达产物对matrigel辅助的内皮细胞管化有明显抑制作用。上述结果表明用毕赤酵母表达了有活性的arresten。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在毕氏酵母中的表达及生物活性分析

采用PCR扩增hVEGF165基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichi a pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/hVEGF165,经转化酶母宿主菌KM71,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,1％甲醇诱导表达。 表达产物在Heparin-Sepharose CL6B亲和层析经后,以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）测定其生物学活性。SDS－PAGE分析显示,表达产物以可溶性分子形式存在上清中,诱导4天的表达量达上清总蛋白质的60％以上。Western印迹表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Heparin-SepharoseCL6B亲和层析纯化,rhVEGF165的纯度可达到90％以上。体内、外生物学活性研究证实其具有刺激HUVEC增殖和促进肢体缺血性动物模型侧枝循环建立的功能。     

血管内皮生长因子与肿瘤

血管内皮生长因子是新近确定的一种具有旁分泌机制的生长因子,能特异作用于血管内皮细胞,促进其增殖及新生血管的形成,同时还有增加血管通透性的作用．由于其生物学活性与实体瘤的生长密切相关,因此对它的研究倍受关注,进展非常迅速．     

血管内皮生长因子受体1酪氨酸激酶的克隆、表达和功能

血管内皮生长因子受体 1(Flt 1)在血管生成过程中起着重要的作用。Flt 1胞内域的酪氨酸激酶直接参与了VEGF与Flt 1结合后的胞内信号转导途径。在原核系统中表达得到具有酶活性的Flt 1酪氨酸激酶融合蛋白 ,并进行了初步的性质研究。利用逆转录PCR技术从人肝癌组织总RNA中得到Flt 1酪氨酸激酶区的cDNA ,将其克隆到表达载体质粒 pGEX KG中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS中表达、纯化 ,得到可溶的Flt 1酪氨酸激酶融合蛋白 (GST F)。虽然GST F不包含目前已知的磷酸化位点 ,但研究表明GST F能够进行自磷酸化反应 ,并且其活性需要镁离子或锰离子的参与。同时发现GST F能够磷酸化合成底物 polyE4Y ,而不能作用于MBP和Src相关肽。底物磷酸化时最适的镁离子和锰离子浓度分别为 15mmol/L和 0 .5mmol/L。GST F为寻找抗肿瘤药物提供了一个有效工具     

重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化

目的：建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子（mVEGF）的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法：通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZaA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、SephadexG25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Westelqq印迹验证纯化蛋白;通过PNGaseF酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果：获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GSll5表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×10^3,在非还原状态下约为40×10^3;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×10^3左右,证明目的蛋白发生了Ⅳ-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论：利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。     

在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF121)为氨基端4个氨基酸缺失的异构体

为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。     

利用重组杆状病毒在家蚕中表达人血管内皮细胞生长因子

家蚕作为“生物工厂”生产重组蛋白质具有很多优势 .构建携带编码人血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 16 5个氨基酸的cDNA的重组杆状病毒 .将此重组病毒接种 5龄家蚕幼虫进行重组蛋白的表达生产 .时相表达分析表明 ,感染后大约 80h时表达水平达到最高 ,而且重组蛋白主要存在于血淋巴中 .从感染的幼虫收集血淋巴并用Nickle亲和层析纯化重组蛋白产物 .定量分析表明 ,每条家蚕幼虫的表达水平高达 4 2 6 μg左右 .通过细胞培养体外分析 ,发现与对照相比 ,加入纯化的重组VEGF(10ng ml和 10 0ng/ml)能够使人HUVEC细胞体外培养细胞数增加 1 8～ 3 3倍 ,说明家蚕幼虫表达的重组VEGF具有完全的生物活性 ,能够诱导内皮细胞在体外分裂增殖 .