人PRR11启动子的结构与功能初步分析

PRR11（proline-rich protein 11,PRR11）是我们最近发现的一个新的肿 瘤相关基因.初步研究表明, PRR11参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生 物学过程．为了进一步研究PRR11基因的转录调控机制并全面解析其功能,本研究 对PRR11基因的启动子进行了克隆鉴定和初步分析．首先,应用5' RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了PRR 11基因的转 录起始位点,发现了其具有多个转录起始位点．通过PCR定向克隆和DNA blunting 技术,构建了6个相互重叠并覆盖PRR 11基因转录起始位点附近约2.0 kb区域的 PRR 11基因启动子荧光素酶报告基因重组体．启动子活性分析表明,PRR 11基因 启动子主要定位于转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域内．采用转录因子 结合位点预测分析软件分析表明,PRR 11基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有 典型的GC盒、CCAAT盒以及潜在的经典转录因子E2F1和MYB的结合位点,提示Sp1、 NF-Y、E2F1和MYB等经典转录因子可能参与PRR 11基因的转录调控．     

人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′ RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5 kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5 kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控     

人FAM33A基因启动子的克隆与鉴定

目的鉴定人FAM33A基因的启动子,为进一步研究其转录调控机制奠定基础。方法采用5’RACE技术（5’端cDNA快速扩增）鉴定FAM33A的转录起始位点。采用PCR定向克隆、酶切亚克隆等策略,构建FAM33A启动子荧光素酶报告基因。采用Lipofeetamine^TM2000转染H1299细胞,并通过Dual-Lu-ciferase@ Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测。结果确定了FAM33A的转录起始位点,构建了覆盖FAM33A 5’端ATG附近约2kb区域的一系列FAM33A启动子荧光素酶报告基因。启动子活性分析表明,这些重组体均具有较高的启动子活性,同时含有典型的GC盒以及Sp1、E2F和GATA-1等潜在的转录因子结合位点。结论FAM33A启动子区域主要定位于转录起始位点附近约590bp的区域内。     

人NPCEDRG基因启动子的克隆及CCAAT/NFY结合位点初步分析

NPCEDRG基因是采用基因定位候选克隆策略获得的一个鼻咽癌候选抑瘤基因.NPCEDRG在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,重新恢复NPCEDRG基因在CNE2细胞系的表达,可部分逆转CNE2的恶性表型.为揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,联合应用生物信息学和报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因启动子区进行克隆及功能分析,系统发育进化足迹分析结果表明,NPCEDRG基因5′端调控区-180～+235 bp区间在脊椎动物中高度保守,该保守区域中存在包括CCAAT/NFY、STAT1和SP1等转录因子结合位点.构建Luc和/或EGFP报告基因表达载体并检测其启动子活性,-146～-8 bp区域有较强的启动子活性,电泳迁移阻滞分析实验(EMSA)提示,CCAAT/NFY转录因子结合位点是NPCEDRG基因的转录调控元件.因此,研究确定-146～-8 bp区域是NPCEDRG基因核心启动子区域且启动子核心元件CCAAT/NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控.     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.     

抑瘤基因NGX6启动子的克隆与功能鉴定

NGX6是一个结直肠癌候选抑瘤基因,其转录调控机制不明．采用生物信息学技术预测其启动子区,并构建NGX6启动子荧光素酶报告基因重组体pGL3/Enhancer/1126．荧光素酶活性检测结果表明该区域具有强启动子活性．应用PromoterInspector program,FistEF,CpGplot和MatInspector Professional软件分析发现,NGX6基因转录调控区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区．凝胶迁移阻滞实验确定NGX6基因启动子区域具有Sp1特异性结合位点,Sp1特异性阻断剂光神霉素(mithramycin A)能明显抑制NGX6启动子的活性和NGX6基因的表达;封闭内源性Sp1能下调NGX6基因mRNA表达水平．     

呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析

目的：探讨呼吸道黏蛋白（mucin,MUC）5AC基因5'上游序列顺式调控元件在中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase , NE)诱导MUC5AC基因转录表达的调控机制。方法：应用DNA重组技术,构建含萤光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒。采用定点突变技术,在嵌合质粒的基础上构建MUC5AC启动子区特殊蛋白（specificity protein）-1和核因子(nuclear factor, NF)-κB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性。结果：成功构建了4种含有不同长度MUC5AC基因启动子序列的荧光索酶报告基因质粒。含有启动子序列-1330bp、-689bp、-324bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度较对照组均显著增加,而含有启动子序列-64bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度与对照组相比差异无统计学意义。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导Sp-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：MUC5AC 5'上游序列中-324～-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用,该位点可能作为靶向性基因治疗的关键调控元件。     

人ACER2基因启动子的鉴定与初步分析

碱性神经酰胺酶2(alkaline ceramidase 2,ACER2)是一个参与脂质类信号分子神经酰胺代谢的酶分子,在细胞增殖、衰老和凋亡等过程中起重要作用。为了进一步研究ACER2基因的转录调控机制,该研究克隆鉴定了ACER2基因的启动子。首先,应用5'RACE(rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了ACER2基因的转录起始位点。然后,通过PCR定向克隆和定点突变策略,构建了三个长度不同的覆盖ACER2基因5'端侧翼区起始密码子ATG上游约1.3Kb区域的一系列ACER2基因启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析表明ACER2基因启动子定位于转录起始位点附近约670 bp的区域内。转录因子结合位点分析结果表明,ZCER2基因启动子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和GATA-1等转录因子可能参与ACER2基因的转录调控。     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

凝血因子FXIII A链基因第1内含子内顺式调节元件的鉴定

探讨FⅩⅢ A基因表达的分子机制.凝胶阻滞实验（EMSA）结果证明,FⅩⅢ A基因第1内含子5′区的前12碱基与转录因子结合并由此调控基因表达.FⅩⅢ A基因第1内含子第12位碱基由C突变为A(内含子1 (+12)C→A)导致与转录因子结合能力降低.构建不同的荧光素酶表达质粒Luc 1、Luc 2、Luc 3、Luc 4、Luc 5、Luc 6,并转染U937细胞和HepG2细胞.结果显示,如果Luc 5（具有最高表达活性）的内含子1(+12)由C突变为A,启动子活性显著降低.与Luc 5相比,突变后的Luc 5的活性分别下降了52.9％（U937, P＜0.01）和47.6％（HepG2, P＜0.01）.将Luc 5与PN3 Sp1共同转染U937细胞和HepG2细胞后,Luc 5的荧光素酶活性分别提高了42.4％（U937,与Luc 5单独转染比较P＜0.01）和54.9％（HepG2, 与Luc 5单独转染比较P＜0.01）,而突变后的Luc 5（Mut）与PN3 Sp1共同转染则没有明显的改变.表明转录因子Sp1在FⅩⅢ A基因表达的重要性.这些结果也表明,内含子在FⅩⅢ A基因表达过程中起重要作用,为遗传性凝血因子发病机理的研究提供了新的证据.