mTOR及其底物在HeLa细胞的细胞周期不同时相中的表达

为探讨细胞生长的机制 ,用RT PCR、Western印迹及蛋白激酶活性测定等方法对同步化的HeLa细胞的细胞周期不同时相中mTOR(mammaliantargetofrapamycin) ,p70S6激酶 (p70S6K)的α1 、α2 、β1 、β2 不同亚型及起始因子 4E结合蛋白 1 (4EBP1 )的表达进行了检测 .RT PCR的结果表明 :在G1 、S1 、G2 、M1 、M2 几个细胞周期时相中 ,mTOR的mRNA表达无明显变化 .mTOR的底物P70S6K的亚型α1 、α2 、β1 、β2 在M期表达均有明显增加 .4EBP1的表达在M期明显减少 .免疫印迹的结果与RT PCR的一致 ,即M期p70S6K的α1 、α2 、均有增加 ,4EBP1在M期减少 .活性测定表明 ,G2 期、M期mTOR较其它期有明显增加 ,4EBP1在M期活性有所下降 .研究结果表明 :mTOR、p70S6K、4EBP1很可能在HeLa细胞的生长中起重要的调节作用     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的感染对Sf9细胞周期的影响

病毒的感染导致细胞内部发生一系列变化.应用流式细胞仪FACS的荧光检测,测出Sf9细胞完成整个周期循环大约需要18h,G\-1、S、G\-2/M各时相的时间间隔约为6h;AcNPV感染Sf9细胞12-18h,细胞被抑制于G\-2/M期;Sf9细胞同步于G\-1/S期后释放细胞并用AcNPV感染,12h后,2/3的细胞处于G\-2/M期,1/3的细胞处于S期.     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的感染对Sf9细胞周期的影响

病毒的感染导致细胞内部发生一系列变化。应用流式细胞仪FACS的荧光检测 ,测出Sf9细胞完成整个周期循环大约需要 18h ,G1、S、G2 /M各时相的时间间隔约为 6h ;AcNPV感染Sf9细胞 12 18h ,细胞被抑制于G2 /M期 ;Sf9细胞同步于G1/S期后释放细胞并用AcNPV感染 ,12h后 ,2 / 3的细胞处于G2 /M期 ,1/ 3的细胞处于S期     

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.     

CDC25B蛋白亚细胞定位调控小鼠1-细胞期受精卵发育

为探讨小鼠细胞分裂周期25B（CDC25B）蛋白149位丝氨酸磷酸化状态对小鼠1 细胞期受精卵中CDC25B的亚细胞定位和发育的影响,应用定制的CDC25B-pS149位的 磷酸化和非磷酸化抗体检测小鼠1-细胞期受精卵各细胞时期的磷酸化和非磷酸化状 态;应用免疫荧光观察各期受精卵中CDC25B蛋白的定位情况;将质粒pEGFP-CDC25B -WT、pEGFP-CDC25B-S149A和pEGFP-CDC25B-S149D融合质粒及空载体质粒显微注射入 G1期受精卵中,观察不同显微注射组小鼠1-细胞期受精卵中外源性CDC25B蛋白亚细 胞定位．结果显示,CDC25B-S149位丝氨酸在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化 ．1-细胞期受精卵从G2向M期的转换过程中,发生了CDC25B向细胞核区的移位,到2- 细胞初期,部分CDC25B蛋白又从细胞核回到细胞浆．实验结果提示,小鼠1-细胞期受精卵G2/M期转换过程中,CDC25B 的S149位点磷酸化修饰可能是对CDC25B细胞内定 位及其活性的精确调节方式．     

integrin β1在不同细胞周期肝癌细胞与内皮细胞粘附中的作用

探讨了integrin β1在不同细胞周期人肝癌细胞(SMMC-7721)上的表达和在肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞粘附过程中的作用.未同步处理的肝癌细胞(对照组)各细胞周期时相百分比为G0/G1期53.51%、G2/M期11.01%、S期35.48%,采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法获得G1期和S期的肝癌细胞,其同步率分别为74.09%和98.29%.G1期肝癌细胞integrin β1表达的荧光强度较S期和对照组相应值明显降低.利用微管吸吮技术定量研究了肝癌细胞与内皮细胞之间的粘附力学特性,发现G1期肝癌细胞的粘附力值比S期相应值明显降低(P＜0.01),而S期的粘附力值与对照组比较无明显差别,integrin β1在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中的贡献约50%.结果提示胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱能较好地将肝癌细胞同步于G1期和S期,integrin β1在SMMC-7721肝癌细胞上的表达水平呈现周期差异,在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大,integrin β1在这一粘附过程中起着重要作用.     

BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞周期进程所必需的

B型细胞周期蛋白(Cyclin B)是细胞G2期向M期转化的重要调节因子. 家蚕基因组数据分析表明, 家蚕有2个Cyclin B基因, 即BmCyclin B和BmCyclin B3. 利用家蚕EST数据, 成功克隆了家蚕Cyclin B3基因(EU074796), 该基因全长1665 bp, ORF长1536 bp, 由6个内含子和7个外显子构成, 编码511个氨基酸, 含有1个蛋白破坏盒和2个周期蛋白盒, 预测分子量57.8 kD. 家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的BmCyclin B和BmCyclin B3基因RNA干涉结果表明, BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞完成细胞周期进程所必需的, 二者干涉后均能导致细胞周期阻滞于G2/M期, 抑制细胞的增殖.     

顺铂靶向食管癌细胞周期Cx43表达的研究

目的:为研究顺铂治疗食管鳞癌细胞的靶向作用。方法:本研究使用流式细胞技术双变量分析检测顺铂对食管癌细胞周期进程和癌细胞周期的连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。结果:顺铂对食管鳞癌细胞周期的影响主要作用于S期的DNA复制,细胞阻滞于S期,G2/M期减少。顺铂诱导食管鳞癌细胞周期S和G2/M期的Cx43表达的大幅度改变。低浓度顺铂(由0~2μmol/L),Cx43表达增强;顺铂渐高浓度(2~12μmol/L),细胞Cx43表达由强逐渐变弱,特别是G2/M期细胞的Cx43表达活跃,易受顺铂影响。结论:我们的研究表明以顺铂处理食管鳞癌细胞,癌细胞周期的S期和G2/M期的Cx43表达与S期的DNA复制一样可作为的潜在治疗靶标。顺铂靶向作用细胞周期S和/或G2/M期细胞的特性可能减少或避免对非分裂细胞的影响。     

流式细胞术BrdU/DNA 双染法测定云芝糖肽 诱导的Molt-4 细胞周期阻滞

目的:探究云芝糖肽(PSP)对人急性淋巴母细胞白血病Molt-4细胞周期的影响。方法:采用流式细胞术BrdU/DNA双染法获得各时相细胞分布状况和细胞周期的动力学参数。结果:0.1 mg/mlPSP处理12 h后,G2/M期细胞百分比由对照组的11.09%减少至3.69%。DNA合成时间由12.10 h延长至108.40 h。24 h处理组中,S期细胞百分比由对照组的43.29%增加至67.26%,而G0/G1期和G2/M期细胞百分比均减少,G0/G1期细胞百分比由对照组的37.47%减少至27.43%,G2/M期细胞百分比由对照组的19.24%降低至5.31%。DNA合成时间更是由11.95 h延长至114.52 h。结论:PSP对人急性淋巴母细胞白血病Molt-4细胞周期的阻滞作用在于S期,该作用与DNA合成抑制有关。     

血小板衍生生长因子受体β对骨肉瘤细胞株HOS增殖的影响

血管形成是肿瘤生长过程中不可或缺的因素。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)通过与其配体结合刺激新生血管形成,与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究表明其亚型PDGFRβ高表达于大多数骨肉瘤病人标本及细胞株中,促进肿瘤增殖,但具体机制仍未明确。在本研究中,分别对HOS骨肉瘤细胞株进行特异性配体PDGFBB刺激处理及小干扰RNA (siRNA)敲降PDGFRβ处理,然后检测其增殖、细胞周期及相关蛋白的表达。结果表明:经过PDGFBB刺激后细胞增殖能力增强;细胞周期结果显示处于G1期的HOS细胞数量增多,S期和G2/M期细胞数量减少,G2期相关蛋白Cyclin B1和CDK1以及G1期相关蛋白CyclinE2和CDK2表达增高,提示PDGFBB可能促进了G2/M期转化。而经siRNA干扰后,PDGFRβ在mRNA和蛋白水平均显示表达量下降;细胞增殖受到抑制。检测细胞周期结果发现在敲降PDGFRβ后,进入S期的细胞数量增加了约9.71%,而G2/M期的细胞数量约减少了6.78%,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2明显降低,提示发生了S期阻滞。因此我们推测,PDGFRβ通过调控细胞周期进程影响骨肉瘤细胞的增殖。本研究为PDGFRβ影响HOS细胞增殖及其潜在机制提供了理论依据,为PDGFRβ可以作为治疗骨肉瘤的潜在治疗靶点提供了理论依据。     

甲醛导致细胞周期异常的浓度选择性

一定浓度的甲醛可以引起蛋白质的异常修饰、功能丧失、细胞死亡。虽然甲醛的细胞毒性已见报道,但甲醛影响神经细胞周期及其分子机制等尚不明确．本文采用不同浓度甲醛与神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y共孵育,观察到甲醛对细胞周期的影响取决于甲醛的浓度．当甲醛浓度([FA])≤0.1 mmol/L(细胞培养48 h),细胞周期与对照相比,无显著性差异．当甲醛浓度增加(0.1 mmol/L <[FA]≤0.2 mmol/L),S期和G2/M期细胞比例显著增加;当[FA] = 0.3 mmol/L时,细胞增殖被显著抑制,大量细胞滞留在S期(46.28%),G2/M期细胞仅占16.05%．将细胞同步到G2/M期,用0.1～0.3 mmol/L甲醛孵育,尽管G2/M期细胞都有一定程度的减少,但S期细胞显著增加;将细胞同步化到S期,与0.1 mmol/L甲醛孵育,则G2/M期细胞有一定程度的减少;与0.3 mmol/L甲醛孵育,表现为G2/M细胞显著减少,S期细胞极度增加．在相同条件下,Sprague-Dawley (SD)大鼠原代皮层神经元,也表现出G2/M期细胞比例随甲醛浓度升高而降低,S期细胞比例随之增加的现象．当0.1 mmol/L≤[FA]≤0.2 mmol/L时,细胞出现明显的早期或晚期凋亡;当[FA]≥0.3 mmol/L时,DNA损伤明显,细胞出现凋亡和部分坏死．以上结果提示,低浓度甲醛(0.1 mmol/L≤[FA]≤0.2 mmol/L)主要通过引起DNA超甲基化而抑制S期DNA的合成,高浓度甲醛([FA]≥0.3 mmol/L)则造成DNA的损伤,从而影响细胞周期的进程．     

GRP78在食管癌细胞ECA-109增殖过程中的功能研究

食管癌在中国是高发性肿瘤,并具有较高的致死率。肿瘤细胞的持续增殖与细胞增殖失调密切相关。肿瘤细胞在增殖过程中需要合成大量蛋白质,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatedprotein,GRP78)作为分子伴侣,在蛋白质的折叠、组装、修饰和错误折叠蛋白的降解过程中发挥着重要作用。该研究通过构建pGRP78-EGFP-N1重组质粒,瞬时转染ECA-109细胞,研究GRP78过表达对细胞增殖能力的影响;采用RNA干扰技术,瞬时转染靶向GRP78的siRNA,研究敲低GRP78对细胞增殖能力的影响。该研究发现GRP78过表达后,更多的细胞从G1期进入S期和G2/M期,细胞增殖速率加快,细胞克隆形成率亦明显提高;敲低GRP78后,细胞更多地被阻滞在G1期而无法进入S期和G2/M期,细胞增殖速率减慢,细胞克隆形成率降低。GRP78可能通过调节细胞周期而促进ECA-109细胞的增殖。     

蛋白激酶C与细胞周期

近年的研究表明,PKC涉及到细胞的周期调节。在酵母细胞和哺乳动物细胞均发现PKC参与细胞周期调控,从而提示PKC可能在进化上是一种保守的细胞周期调节子。一般认为PKC在两个点上对细胞周期起作用,即G1期和G2期到M期的过渡期（G2／M）。在G1期,PKC分别在早G1期和晚G1期作用有所不同,主要作用表现在使细胞停留在G1期的中末阶段,这一过程,主要涉及到抑制肿瘤抑制因子－成视网膜细胞瘤（Rb)蛋白的磷酸化。PKC的主要作用是降低周期素依赖激酶CDK2的活性、降低周期素E和A的表达和增加周期素依赖的周期抑制蛋白p21^WAF1和p27^KIP1的表达;在G2／M期,PKC对细胞周期的调节主要与Cdc2(CDK1)的活性抑制有关。     

连续光照转暗培养联合药物处理实现衣藻细胞的高水平同步化

单细胞衣藻(Chlamydomonas)是光合作用和植物细胞周期等生物学过程研究的一个重要模式系统, 同步化培养是进行相关研究的必要手段。该研究探索了连续光照转暗培养联合细胞周期阻断剂实现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)细胞高水平同步化的新方法, 并利用流式细胞术对同步化程度进行了精确的分析。结果表明, 连续光照转暗培养或联合S期阻断剂可以使衣藻细胞同步化到G1期或G1/S期边界; 连续光照转暗培养联合M期阻断剂或者在“加入-释放”S期阻断剂后再加入M期阻断剂可以使衣藻细胞同步化到M期, 同步化水平可达80%。具体的同步化培养步骤要根据研究对象(特别是某些衣藻突变株系)的特性和研究目的确定。     

FoxM1与癌发生的相关剪接机制的探讨

FoxM1是一种原癌基因。它也是癌发生、发展密切相关的重要的转录因子。Fox M1是Forkhead Box转录因子家族重要成员,定位于染色体12p13.3,特异性表达于增殖期细胞中,在细胞终末分化时消失,是一个典型的与细胞增殖相关的转录因子,在细胞G/S及G/M期转换过程中发挥重要作用。它具有Fox M1A、B和C三种剪接异构体。Fox M1B和C在癌组织中高表达,发挥转录激活、促癌发生和发展的作用,而Fox M1A在癌组织中低表达,发挥转录抑制功能。癌组织中Fox M1B/C的优先选择对于Fox M1发挥促癌作用非常关键。因此对这一现象的成因即Fox M1癌相关选择性剪接机制的研究非常重要。     

流式细胞术BrdU／DNA双染法测定云芝糖肽诱导的Molt-4细胞周期阻滞

目的：探究云芝糖）Ik（PSP）对人急性淋巴母细胞白血病Molt-4细胞周期的影响。方法：采用流式细胞术BrdU／DNA双染法获得各时相细胞分布状况和细胞周期的动力学参数。结果：0．1mg／mlPSP处理12h后,G2／M期细胞百分比由对照组的11．09％减少至3．69％。DNA合成时间由12．10h延长至108．40h。24h处理组中,S期细胞百分比由对照组的43.29％增加至67．26％,而G0／G1期和G2／M期细胞百分比均减少,G0／G1期细胞百分比由对照组的37．47％减少至27．43％,G2／M期细胞百分比由对照组的19．24％降低至5.31％。DNA合成时间更是由11．95h延长至114．52h。结论：PSP对人急性淋巴母细胞白血病Molt-4细胞周期的阻滞作用在于S期．该作用与DNA合成抑制有关。     

dbcAMP通过Cdc25B蛋白调控小鼠1-细胞期受精卵发育

为了研究PKA激活剂dbcAMP通过调控小鼠Cdc25B蛋白S149和S321位点磷酸化状态影响 小鼠1-细胞期受精卵的发育,将质粒pBSK-Cdc25B-WT、pBSK-Cdc25B-S149A、pBSK- Cdc25B-S321A和pBSK-Cdc25B-S149A/S321A体外转录成mRNA;显微注射入S期受精卵中 ,在2 mmol/L dbcAMP的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、MPF活性及CDC2- pTyr15磷酸化状态的影响. 结果显示,在有dbcAMP存在时,各组受精卵卵裂时间延迟 ,但Cdc25B-S/A mRNAs注射组受精卵卵裂率明显高于Cdc25B-WT mRNA注射组,MPF 活性提前达到高峰;CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致. 因此,在小鼠1- 细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Cdc25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化 修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.     

巨细胞病毒感染致MRC-5细胞周期及Cyclin E表达的变化

本文研究了巨细胞病毒感染人二倍体细胞MRC-5后诱导产生高水平Cyclin E,Cyclin E/cdk2激酶活性增加和导致细胞周期阻滞.应用流式细胞仪分析表明10PFU/cell的病毒量感染MRC-5细胞72h后,29%细胞位于S期,69%细胞位于G2/M期,只有2%细胞位于G1/G0期.应用双抗夹心ELISA法检测,感染病毒20h后,MRC-5细胞中Cyclin E含量比对照细胞高出8倍.感染细胞中CyclinE/cdk2激酶活性基本上与CyclinE含量相关联.     

DADS诱导HL-60 G2/M期阻滞消减文库的构建与初步筛选

目的:构建DADS诱导HL60-细胞G2/M期阻滞的差异表达文库,初步筛选相关基因.方法:分别提取无DADS和有DADS处理HL-60细胞的总RNA和mRNA,构建消减cDNA文库.随即挑选正向SSH的阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序.Blastn分析差异cDNA片段的同源性.结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,其中包含120个正向SSH的克隆和100个反向SSH的克隆.50个随机正向SSH的克隆测序、比较同源性,发现5个新EST片段,已经在GenBank中登录.结论:所构建的DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞消减文库为进一步筛选白血病HL-60细胞G2/M期阻滞相关基因奠定了基础.     

利用稻瘟霉分生孢子筛选抗肿瘤放线菌

利用稻瘟霉分生孢子萌发时菌丝形变为指示,从150余株放线菌中筛选到一株抗肿瘤活性很强的菌株JXJ-0108,并从其发酵液中纯化到一个抗肿瘤活性较强的化合物JXJ-0108-1,该化合物在治疗胃癌和肝癌的药物研制中具有潜在的价值。四氮唑盐酶还原法(MTT)体外研究表明,JXJ-0108-1对人肝癌细胞BEL-7402和人胃癌细胞BGC-823的IC50分别为1.63和0.95 ug/mL;流式细胞仪分析表明,分别从0.50和0.30 ug/mL的化合物作用浓度开始,与空白对照组相比,肝癌细胞BEL-7402和胃癌细胞BGC-823的G0/G1、S和G2/M期细胞比例有极显著差异,其中G0/G1和S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例上升。本文为抗肿瘤放线菌的筛选及活性成分的跟踪分离提供了一个快速简便的有效方法。