高等植物基因表达与转录因子

基因在植物体内的表达受到了严格的调控;不同基因,其表达程度不同。例如,与发育及分化有关的基因在表达时还有“时空和空间”的专一性问题,即它们只在特定组织中表达,而且只在特定的发育阶段表达。可见,高等植物基因表达调控起到了维持正常的生长、发育等一切生命活动的作用。目前,高等植物基因表达调控机制研究,已成为植物分子生物学的热点与中心问题,而在转录水平上基因表达调控的研究是这一热点中的重点。本文简要地介绍一下有关这方面的研究进展情况。     

利用GAL4-UAS系统在果蝇中过表达研究人类基因功能

随着人类基因组测序的基本完成 ,大量新基因被发现 ,其中许多只有序列及基因组定位信息。新的焦点是这些新基因的功能研究。模式生物果蝇对此起重要作用。利用转基因果蝇和GAL4 UAS系统初步鉴定功能基因 ,建立了源于 10个不同人类基因的共 5 4个转基因果蝇品系 ,然后用 6种不同的GAL4诱导这些转基因在果蝇中过量表达。其中一个人类基因 ,延伸因子 1alpha 1(EF1α 1)的过表达导致果蝇的背板异常和糙眼表型。该研究表明可在果蝇中利用基因过表达策略初筛人类功能基因 ,这为大规模人类基因的功能研究提供了新的手段     

筛选抑制酿酒酵母生长的人类基因

【目的】基于人类基因文库,构建一个筛选抑制酿酒酵母生长的人类基因的方法,并运用此方法筛选含有生长抑制性人源蛋白质的酿酒酵母,用于分析人类基因的生理功能及其抑制剂的寻找。【方法】利用Gateway~(TM)重组技术将人类蛋白质编码基因构建到酿酒酵母表达质粒中。得到的质粒分别转化酿酒酵母细胞中,分析哪些基因的表达会抑制酿酒酵母的生长,并用绿色荧光蛋白标签对典型候选基因在酿酒酵母中的定位进行观察。【结果与结论】本研究建立了抑制酿酒酵母生长的人类基因的筛选方法,并运用此方法成功地从2991个人类蛋白质编码基因中筛选到29个显著抑制酿酒酵母生长的基因。其中一些是引起人类疾病的致病基因。例如,PDLIM4参与到骨质疏松症和前列腺癌的形成和发展,但其生理功能尚不清楚。我们的研究可能为揭示这些候选基因的功能和调节机制提供新的途径。     

大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定

采用新发展的抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）在基因组水平筛选再生肝中高表达基因。大鼠肝部分切除后24h的再生杆组织来源的cDNA作为受检者（tester）,正常肝组织的cDNA作为驱动者（driver）,进行差减杂交,获得一900个克隆的差减杂交库,随后对差减克隆进行了差异筛选,得到50个在再生肝中高表达的强阳性克隆,序列测定和同源比较表明这些克隆代表了37个基因,其中13个与已报道的肝再生相关的基因同源,15个为忆知基因但首次发现与肝再生相关,9个为新的基因（EST）已被GenBank收录。制备了标准化RNA点杂交膜,通过对上述部分基因的RNA点杂交分析,不但确认了这些基因在再生肝中表达水平的升高,同时发现它们在肝再生过程中有不同的表达模式。实验结果提示这些基因在肝再生过程中具有重要功能。     

肾细胞癌DNA甲基化标记检测的重复性及其与基因表达改变的相关性

DNA甲基化是影响基因表达的重要因素之一。DNA甲基化芯片已广泛应用于寻找癌症的标志物,但是目前还没有研究对这些标志物的重复性进行评价。另外,DNA甲基化对基因表达的影响也存在争议。在本文中,通过分析肾细胞癌的两套甲基化数据,发现它们的差异甲基化基因的方向高度的一致,证明通过甲基化芯片获得的甲基化标记有很高的重复性。进一步分析甲基化基因对应的表达改变,发现肾细胞癌中高甲基化的基因显著影响表达下调,而低甲基化的基因与表达改变无显著关系。最后,通过功能分析,找到了三个同时发生甲基化和表达改变的通路。针对这些通路研究DNA甲基化抑制剂,可能有助于肾细胞癌的靶向治疗。     

水稻种子发育期间特异锌指蛋白基因的筛选与分析

.锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一.大部分的锌指模体存在于转录因子中,它们在转录水平上参与植物生长发育及植物对生物和非生物胁迫的反应.为了解锌指蛋白基因在水稻种子发育中的作用,本研究通过多种数据库搜索获得了878个水稻锌指蛋白基因.从中选取311个利用RT-PCR技术分析它们在水稻成熟期根、茎、叶、花及不同发育阶段种子中的表达特征.结果发现,共有196个基因能在至少1个水稻器官中表达,其中10个为种子特异性表达基因.进一步分析发现,10个特异表达基因在水稻种子不同发育阶段中的表达具有种子阶段表达特异性.同时分析它们的基因及蛋白结构特点,结果显示它们的结构较简单,其中3个蛋白含有线粒体靶肽,5个蛋白含有CCCH锌指结构域.另外,分析种子特异性表达基因上游调控区的顺式作用元件,结果表明它们都含有TATA-box、CAAT-box和种子特异调控元件,除此之外还发现了光、激素和胁迫反应相关调控元件.这些结果为进一步研究它们在种子发育过程中的生物学功能提供了有用的线索.     

应用基因芯片筛选鼻咽癌信号转导相关基因

目的：建立具有组织特异性的鼻咽癌基因表达谱,筛选鼻咽癌中信号转导相关基因。方法：采用深圳微芯公司基于玻片的包含8046个人类基因的基因芯片,检测7例鼻咽癌组织及1例鼻咽炎组织,初步获得鼻咽癌异常表达基因;结合GO分类从异常表达的基因中筛选信号转导相关基因,以Biocarta信号通路数据库查询筛选基因相关转导信号通路信息。结果：在鼻咽癌组织独得1241个异常用表达基因,其中高表达基因871个,低表达基因343个。发现28个差异表达基因与细胞的信号转导相关,其中表达上调的21个,表达下调的7个。结论：成功建立了具有组织特异性的鼻咽癌基因表达谱,初步获得了鼻咽癌信号转导相关基因。     

毛竹中NYE基因的分离及功能分析

AtNYE1是拟南芥叶片衰老过程中叶绿素降解的重要调控基因,本文用AtNYE1为诱饵基因,通过NCBI tblastn在毛竹的cDNA文库中找到3个与其相似性较高的cDNA全长序列,分别命名为PeNYE1、PeNYE2和PeNYE3。为了验证其是否具有AtNYE1相似的功能,分别将它们的编码区构建到带有花椰菜花叶病毒35S强启动子的植物表达载体上,并通过冻融法将这3个表达载体导入GV3101农杆菌。通过农杆菌介导法,将这3个基因分别在烟草叶片中瞬时表达及在拟南芥植株中稳定表达,结果显示,瞬时过表达和组成型过表达PeNYE1均导致了叶片的黄化,而瞬时或组成型过表达PeNYE2或PeNYE3均未观察到黄化表型。这些结果表明PeNYE1是毛竹中叶绿素降解的重要调控基因。     

蛋白质将成为生物学研究重点

在科学家对人类基因组进行初步研究后发现 ,人类的基因数量远少于原来的预想 ,科学家由此认为 ,生命的特性并不是全部由基因决定的。人类基因只有 3万至 4万个 ,而蛋白质却有 2 5万种 ,因此对蛋白质研究将成为今后生物学研究的一个新学科前沿。科学家研究发现 ,人类基因是果蝇的两倍 ,比老鼠多 30 0个 ,远少于人类有 6万至 10万个基因的原来预测。负责人类基因组研究科学家认为 ,这表明也许基因并不能包含生命的全部信息 ;同时也表明科学家原来的观点 ,认为一种基因只负责合成一种蛋白质可能是错误的 ,一种基因可能要负责合成几种蛋白质。美…     

RNAi技术降低头孢菌素C工业生产菌株中cefG基因的转录

RNAi是近年来新兴的一种通过抑制基因转录水平来实现特定基因表达沉默的技术。本研究尝试在顶头孢霉工业生产菌株中利用RNAi技术沉默cefG基因的转录,构建了一个含可形成cefG双链RNA转录单元的质粒,并将其导入头孢菌素C工业生产菌株中。结果发现其中两个转化子的cefG基因转录水平在发酵第4天较出发菌株降低了80%以上,而它们的头孢菌素C发酵水平较出发菌株则分别降低了34.6%和28.8%。     

我多组学关联分析揭示表观等位基因在拟南芥环境适应性进化中的作用及机制

表观等位基因一般是指仅由DNA甲基化差异引起的表达量不同的等位基因,对植物形态结构和各种生理过程具有重要影响。但自然条件下环境因素对植物表观等位基因的影响还不清楚,同时表观等位基因在植物环境适应性进化中的作用和机制还亟待探究。为了在全基组水平鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)中与特定环境因素相关的表观等位基因,并分析它们参与拟南芥环境适应性进化的可能机制,本研究利用623株拟南芥生态型的转录组、甲基化组和种源地气候数据进行多组学关联分析,并同时进行了蛋白互作网络和基因富集分析。以春季和夏季降水量为例,本研究最终鉴定到5个基因(AGL36、AT2G34100、AT4G09360、LSU4和AT5G56910)可能具有相应的表观等位基因,基因内部或附近特定区域不同甲基化水平对它们的表达可能具有调控作用。其中与种子发育有关的印记基因AGL36首次被发现可能作为表观等位基因参与拟南芥环境适应性进化,其他4个基因均与生物胁迫响应有关。自然条件下降水量能影响当地病虫害的严重程度,而DNA甲基化能通过影响这4个免疫基因的表达来影响拟南芥免疫能力。在长期演化过程中有利于个体适应当地降水模式的表观等位基因受到正向选择,这可能是这些表观等位基因参与拟南芥降水适应性进化的潜在机制。通过蛋白互作网络、GO功能分析和KEGG通路分析,本研究还首次发现LSU4可能与LSU基因家族其他成员一样参与硫代谢网络,并通过影响硫代葡萄糖苷代谢参与拟南芥生物胁迫响应。     

连接蛋白家族,细胞间隙连接通讯与肿瘤抑制

目前,至少已发现编码间隙蛋白的基因－－连接蛋白家族的十个成员。它们的碱基顺序有高度同源性,结构相似,在组织细胞中的分布既有专一性,又有交叉性。连接蛋白基因的表达水平与间隙连接通讯功能的调变相关。在转化或肿瘤细胞中间隙连接通讯功能的丧失常伴随连接蛋白家族蛋白基因的表达,能够抑制肿瘤生长。连接蛋白基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因。     

4龄中华鲟垂体的EST分析

表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST) 是鉴定基因表达规律和发现新基因的一种有效的分子生物学手段。为了能在中华鲟(Acipenser sinensis Gray) 中发现与生长和生殖内分泌调控相关的基因,我们构建了中华鲟垂体的SMART cDNA质粒文库。垂体是调节生长和生殖内分泌的重要器官。在本研究中,通过测序筛选得到了944个EST克隆,将所得EST 与 GenBank 数据库中的序列进行比对, 结果表明,802 (84.96%) 个克隆可以找到同源序列,共代表461个基因, 其中含132个已知功能基因;而 142 (15.04%) 个克隆不能找到同源序列。研究发现,在所有基因中,阿黑皮素原基因 (Proopiomelanocortin, POMC) 是出现次数最高的基因,占总EST数的10.17%, 显示出其在垂体中的重要地位。我们还发现了7个未知功能的基因并重点研究了其在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、精巢、卵巢和垂体等组织中的表达特异性。结果发现,4个基因：EG009334、EG009337、EG009338 和 EG009340为垂体特异性表达或垂体和卵巢特异性表达。对这些基因进一步的功能研究将有利于我们更好地了解中华鲟生长和生殖内分泌调控的分子机制。     

G0101C03-3和L0254H10-3 基因在小鼠动情周期子宫中的差异表达

正常动情周期的维持是小鼠子宫多功能的必要条件 ,但对于其分子基础至今尚不十分明了。我们曾通过基因芯片技术分析了小鼠动情期与间情期子宫的基因表达谱 ,发现了许多差异表达的基因或表达序列标签(ESTs)。本实验选取了G0 1 0 1C0 3 3及L0 2 5 4H1 0 3两个差异表达的EST ,通过Northern印迹与原位杂交方法分析了它们在小鼠动情周期子宫中的时空表达模式。结果表明 :这两个基因的表达水平都发生周期性变化 ,在动情期表达量较少 ,而在间情期表达量较高 ;G0 1 0 1C0 3 3在动情期的表达量是间情期的 2 7% ,L0 2 5 4H1 0 3在动情期检测不到有表达 ,提示它们的表达受卵巢类固醇激素的调控 ;G0 1 0 1C0 3 3基因主要在子宫的腔上皮与腺上皮中表达 ,可能与子宫细胞的程序性死亡有关 ;而L0 2 5 4H1 0 3基因则主要位于基质细胞中     

微小RNA的发现者——安博斯

微小RNA（microRNA,miRNA）是一类拥有基因调节功能的RNA,它们仅由20几个核苷酸构成。通过与靶基因特定互补序列的结合而影响其表达。miRNA最早于1993年由安博斯在研究线虫发育过程中发现,但未引起科学界的注意,直到2001年才掀起研究热潮。miRNA是当前生命科学领域研究的一个热点,已在多个物种中发现其存在,羌参与了多种生理过程,同时也与疾病发生密切相关,有可能在临床疾病诊断和治疗中发挥巨大应用。     

用cDNA-AFLP技术筛选新生牛软骨无血管区的高表达基因

软骨一直被认为是内源性血管生成抑制物的重要来源.为更好理解软骨血管生成抑制的遗传学基础,对软骨中与血管生成抑制有关的基因进行了初步的探索.本研究应用cDNA-AFLP技术对新生牛关节骨骺软骨无血管区和有血管区的差异表达基因进行分析,筛选无血管区特异表达或高表达的基因,共得到43个无血管区高表达的片段.通过对片段进行亚克隆、测序及同源性分析,结果发现,16个片段与已知基因同源,25个片段只在牛的基因组数据库中找到同源序列,另有2个片段未找到同源序列.在同源基因中,肌钙蛋白Ⅰ亚型其血管生成抑制作用已有较详细报道;S100A7与血管生成和肿瘤发生的关系也已有阐述.另外14个同源基因按生物过程分析,发现参与了细胞周期调节、信号传递、细胞间相互作用及新陈代谢等多个生物过程. 研究结果提示,牛软骨组织无血管区的无血管状态可能由多基因介导,其中一些可能是已知或未知的新基因.     

人造锌指蛋白的应用

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体。由于C2H2锌指域靶位点特异性与结构和功能的模块性构成,使得C2H2锌指域成为构建特定的DNA结合蛋白的常用骨架。保持C2H2锌指的基本骨架不变,替换锌指特定位点的氨基酸残基,并融合表达其他功能域就可以得到具有靶向性的人造锌指蛋白(ZFP)。ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达与配体依赖的靶基因激活或抑制;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶,重组酶,整合酶;抗病毒感染等。因此,人造锌指蛋白应用前景广阔,研究价值显著,是未来人类基因治疗的革命性的工具。     

联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找FOXQ1转录因子的下游靶基因

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是一种全球高发的恶性肿瘤,发病原因复杂且预后较差。近年来发现叉头框Q1(Forkhead box Q1,FOXQ1)基因作为一类核转录因子在结直肠癌中高表达,可控制下游基因转录活性。本实验拟探究CRC细胞中FOXQ1的转录调控功能并寻找其下游基因。方法:(1)构建低表达FOXQ1基因的稳定转染CRC细胞株;(2)应用RNA-seq检测FOXQ1敲低前后表达量显著差异的基因;(3)应用转座酶可接近性核染色质区域测序分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-seq)检测FOXQ1敲低前后细胞染色质易接近性的变化;(4)进一步对FOXQ1敲低前后的RNA-seq和ATAC-seq数据进行一系列生物信息学分析,寻找CRC中FOXQ1转录调控的潜在下游基因。结果:应用RNA-seq筛选出了敲低FOXQ1后表达显著差异的基因EI24、TLR2、SMAD3,通过联合分析两细胞系的测序结果,发现FOXQ1基因敲低后,在DLD1和SW480两个细胞系中染色质易接近性均增强且表达量均上调的基因有61个,染色质易接近性均减弱且表达量均下调的基因有70个,且EI24、TLR2、SMAD3基因均位于重叠分析结果中,其中TLR2、SMAD3基因的染色质区域有明显变化,而EI24基因的染色质区域变化不明显。通过代谢通路分析找到了EI24、TLR2、SMAD3基因所富集的代谢通路。其中SMAD3、TLR2基因在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)通路中显著富集。EI24基因在p53信号通路(p53 signaling pathway)通路中显著富集。结论:基于染色质易接近性的变化和转录水平的研究发现:敲低FOXQ1基因对CRC细胞系中染色质的开放情况有较大的影响,且影响FOXQ1转录调控的下游基因的表达。找到了FOXQ1敲低后在SW480、DLD1中均发生变化的基因,为丰富FOXQ1转录因子的下游调控网络提供了研究基础。     

齐墩果酸诱导多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化研究

目的：寻找一种能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的化合物,并以常用的诱导物维甲酸（Retinoic Acid, RA）作为阳性参照物。方法：分别培养小鼠胚胎干细胞1 B10、D3、R1／E,诱导它们形成拟胚体,让拟胚体贴壁生长,加入特定化合物诱导贴壁细胞分化,诱导72 h后,提取被诱导细胞的RNA,再合成cDNA,最后利用实时荧光定量PCR检测各被诱导细胞中与生殖分化相关的基因的表达水平的变化。结果：发现齐墩果酸（Oleanolic Acid,OA）显著上调了所有被研究的小鼠胚胎干细胞的生殖分化关键基因的表达水平,同时发现阳性参照物RA仅能诱导1 B10、R1／E ,而不能诱导D3向生殖细胞方向分化。结论：OA能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化,诱导能力方面具有比常用诱导物维甲酸更广泛的普遍性。     

籼稻细胞色素P450超基因家族成员及其EST证据

将预测的籼稻基因同289个已知的拟南芥细胞色素P450基因进行蛋白质序列比对, 在籼稻(Oryza sativa L. ssp. indica)工作框架草图中找到了528个可能的细胞色素P450基因, 初步认定上述籼稻P450基因来自于已在拟南芥中确定的40个P450基因家族. 比较拟南芥和籼稻的细胞色素P450s在基因家族中的分布, 发现这两种植物P450基因的家族分布规律总体相似, 但也有不同, 例如: CYP71, CYP72, CYP76, CYP89, CYP94, CYP709等家族的成员在籼稻中远远多于拟南芥的; CYP705家族的成员在籼稻中没有, 但在拟南芥中却多达33个. 另外, 发现籼稻CYP71和CYP81家族的成员在基因组中成串联重复排列, 它们可能是进化过程中基因复制的结果. 进一步将这些籼稻P450基因的DNA序列同籼稻表达序列标签(expression sequence tags, ESTs)进行核酸序列比对, 为263个可能的籼稻P450s找到了ESTs的证据, 说明这些基因在转录水平上确实有所表达.