含四个串联核酶和GFP基因的转基因质粒的构建

以含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pSK100-DS、含切割对虾杆状病毒基因的核酶Rz1的质粒pRGRz1、含核酶Rz2的质粒pRGRz2和转基因空质粒pcDNA3为基础,把绿色荧光蛋白GFP基因克隆于pcDNA3的SV40启动了下面,由SV40启动子控制含四个两种核酸基因的四联体克隆于pcDNA3的多克隆位点区,由T7启动子控制,构建成含两个Rz1、两个Rz2和GFP基因的转基因质粒pGTR,以用于转基因抗病毒对虾的研究.     

乙型肝炎病毒adr和adw亚型表面抗原在非洲绿猴肾细胞中的表达

用pSV2-gPt作载体,将乙型肝炎病毒adr亚型的全序列基因和adw亚型的Bgl Ⅱ大片段DNA分别插入PSV 2-gpt BamHI及Bgl Ⅱ切口,获得4种重组质粒。它们都含有SV40DNA复制起始点、早期启动子、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)和氨苄青霉素抗性基因(Apr)。经酶切鉴定,选出正向重组质粒PSV 2-gbr1和pSV 2-gbw1,并分别转化Vero细胞,在选择培养基的压力下,两个质粒所含乙型肝炎表面抗原DNA均得到表达。     

一株动性球菌ZOYM的初步鉴定及其内源性质粒pPCZ1和pPCZ2的分析

从来自中国深海的样品中分离到一株菌株ZOYM, PCR获得其16S rRNA基因序列, 经比对, 与已发表的动性球菌属(Planococcus)的不同种高度相似。提取质粒DNA, 在琼脂糖凝胶上检测到多条DNA带, 对其中2个小的环型质粒pPCZ1和pPCZ2进行了克隆和测序。 pPCZ1和pPCZ2的全长分别为4738 bp和7935 bp, 编码3个和8个蛋白。预测的pPCZ1和pPCZ2的复制蛋白Rep分别与链球菌(Staphylococcus)质粒pSCFS1和芽孢杆菌(Bacillus) 质粒pBM19的Rep有很高的相似性。此外, pPCZ1和pPCZ2的复制蛋白Rep之间也有一定的同源性。质粒pPCZ1和pPCZ2上均未找到滚环复制质粒保守的dso和sso序列, 而在复制基因的上游均发现有多个重复序列和富含AT的序列, 因此, 推测它们可能不是以滚环方式进行复制, 而是theta方式。这是首次报道动性球菌属两个质粒的完整序列。     

杭州市淋病奈瑟菌质粒酶切图谱分析研究

目的 :了解杭州市淋病奈瑟菌质粒携带及质粒谱型分布情况。方法 :采用碱裂解法对门诊 2 0 0 0年 1月～ 2 0 0 1年 10月分离的 2 0 7株淋病奈瑟菌进行了质粒抽提及质粒谱分型研究 ,并对菌株的青霉素耐药现象和耐药性质粒的关系进行探讨。结果 :2 0 7株淋病奈瑟菌中 194株 (93 .7% )检见质粒带 ,其中含一条质粒带的 112株 (5 4.11% ) ,含两条质粒带的 12株 (5 .8% ) ,含三条带的 70株 (3 3 .82 % ) ,尚有 13株(6.2 8% )未检测到质粒。以 E.coli V5 17细菌质粒作分子量标准 ,测得这些分子量分别为 2 .6、4.5、和 2 4.5Md。质粒谱型以 2 .6 4.5 2 4.5 Md(3 3 .82 % )多见。结论 :杭州地区质粒酶切图谱的分析研究有助于淋病的治疗和防治 ,这将对该地区淋病奈瑟菌的分子流行病学调查和淋病监控提供依据     

枯草杆菌和大肠杆菌融合转移双复制功能杂种质粒pTZ22的研究

在大肠杆菌C600(pTZ22)(Km~rTc~rAp~r)和枯草杆菌Ki-2-132(Sm~rIle~-Thr~-Val~-)(简称A系统)以及在枯草杆菌Ki-2-132(pTZ22)(Km~r)和大肠杆菌C600(简称B系统)菌株之间,通过细胞融合,从两个方向转移pTZ22。A系统获得一批抗Km Sm融合子,B系统获得一批抗Km Ap和Tc的融合子,融合频率为10~(-4)—10~(-6)。融合子的抗性是稳定的,并且革兰氏染色、产酶和产孢匦与不带质粒的亲本相同。DNA的电泳图证明,除了不带质粒的亲本无质粒带外,其它菌株都有质粒带,A系的电泳相同,B系的则不同,原因尚不清楚。用融合子的质粒DNA转化ki-2-132和C600都获得了转化体,其转化频率因实验条件不同而有差异。以上结果表明,大肠杜菌和枯草杄菌细胞之间能够相互融合,通过融合能从A、B两个方向转移质粒pTZ22,枯草杆菌的蛋白酶不阻碍细胞融合和质粒转移。     

氨苄青霉素人工抗原的制备及抗体特性鉴定

根据氨苄青霉素(AMP)分子结构上存在的化学活性基团羧基,用碳化二亚胺法(EDC)将AMP偶联于载体蛋白BSA,合成人工抗原BSA-AMP,用紫外扫描(Uv)和SDS-PAGE进行鉴定,推算分子结合比;用BSA-AMP免疫新西兰白兔,间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,琼脂双扩散试验和交叉反应试验鉴定其特异性.结果表明,BSA-AMP偶联成功,分子结合比为1:17.6,获得了高效价、敏感、特异的AMP pAb,为AMP残留免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

用8质粒病毒拯救系统产生H9N2/WSN重组A型流行性感冒病毒

把禽流行性感冒(流感)病毒A／Chicken／Shanghai／F／98(H9N2)的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因cDNA克隆至polⅠ-pol Ⅱ双向转录和表达载体pHW2000,用这两种质粒与8质粒病毒拯救系统中流感病毒A／WSN／33(H1N1)6个内部基因cDNA的质粒组合(6 2重排),共转染COS-1细胞,产生了能在鸡胚中高滴度增殖的H9N2／、WSN重组病毒。用A／WSN／33的8个基因cDNA质粒作对照,也产生了转染子病毒。经过EID50测定和MDCK感染实验,新基因型H9N2／WSN病毒感染鸡胚的能力强(EID50为10^-11／0．2m1),而且对鸡胚的毒力弱,在不加胰酶的情况下不使MDCK细胞产牛病变。经电镜观察,两个转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似。反向遗传操作技术的建立,为对禽流感病毒基因功能和疫苗构建等方面的研究提供了新的手段。     

链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

Ti质粒T区tms基因的分离及其对高等植物分化的影响

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA带有致瘤基因,其基因1和基因2编码生长素吲哚乙酸生物合成途径中的两个酶。以pGV 354(pBR322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15—HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因1和基因2,并构建了带有卡那霉素抗性基因的重组质粒pBZ 692,通过基因载体pGV 3850,我们将基因1和基因2引入了高等植物。结果证明基因1和基因2能促使烟草、向日葵、土豆等转化组织分化长根,转化的根在MS_0培养基上能脱分化形成愈伤组织并自主生长,在转化的组织中有转化标记胭脂碱的存在。     

几种乙型肝炎病毒DNA重组质粒的改建及其在哺乳动物细胞高效表达乙型肝炎表面抗原

将Bgl Ⅱ不完全水解pTHBV一1质粒产生的两种乙型肝炎病毒(HBV)DNA片段插入pSV2-dhft质粒的Bglll切口,构造成{种重组质粒,其结构特点是：1都含有SV40的DNA复制起点和早期启动子;2都含有二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 3·{种重组质粒是在dhfr。基因3’末端分别插入两种大小不同,方向相反的HBV’DNA片段而成。使用这4种质粒DNA分别和tk质粒DNA共转化Ltr细胞,在HAT培养基选择压力下4种质粒都得到有效表达HBsAg。通过换用氨甲喋呤并逐渐增加其药量,从氨甲喋呤抗性细胞中获得高效表达HBsAg的B2和B16细胞系。据固相放射免疫检测结果计算,B16细胞系的HBxAF分泌量可达12．5pg／10’细胞／天．细胞传代4个月表达稳定。这些细胞在HBsAg诊断试剂和疫苗研制中具有潜在的应用价值。     

两类新型DNA质粒pSC1和pSC2的分离与观察

本文报道从一株啤酒酵母E4-2A分离到两类脱氧核糖核酸质粒pSC1与pSC2。经琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA分子,证明这两类质粒的分子量不同于已知的酵母2μmDNA质粒。电镜分析指出这两类新型核外DNA质粒的长度为0．91士0·12μm(pSCl)和0.48士0.10μm(pSC2),经计算分子量分别相当于1．9x106和1．0 x106。pSCI由共价闭环和开环两种构型组成,而pSC2仅有开环型。     

突变质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的构建及表达

[目的]构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表达质粒并观察其蛋白表达。[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,扩增并突变h PROKR2的1-1035 bp(343YFK/AAA345),再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变h PROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pc DNA3.1-h PROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通过测序鉴定突变是否成功。扩增h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),连接入CMV-3flag。Western Blot检测相应蛋白的表达。[结果]成功构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达。[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效。质粒CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件。     

RNA干扰技术抑制BAG-1在大鼠肺泡巨噬细胞表达及恢复GR抗炎效应的研究

目的利用RNA干扰技术,建立脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1基因阻断模型,并阐明BAG-1表达对糖皮质激素受体(GR)抗炎活性的影响。方法构建两个针对BAG-1的RNAi质粒表达载体,分别命名为SiBAG-1α和SiBAG-1β,经测序确认后,转染大鼠肺泡巨噬细胞。细胞免疫组织化学法检测细胞核中BAG-1表达变化;电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测GR活性变化。结果经测序证实:成功构建两个针对BAG-1基因的RNAi(RNA干扰)质粒表达载体SiBAG-1α和SiBAG-1β;转染质粒SiBAG-1α可明显降低胞核内BAG-1蛋白表达(P<0.05),而转染质粒SiBAG-1β对胞核内BAG-1蛋白表达无明显影响;质粒SiBAG-1α转染组细胞GR活性明显明显增强(P<0.05)。结论成功地构建并筛选出一个特异而高效地阻断BAG-1表达的质粒表达载体SiBAG-1α,抑制BAG-1表达可恢复GR抗炎活性,逆转GR活性下降所致的糖皮质激素抵抗。     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

新疆南部和田羊、卡拉库尔羊、多浪羊MSTN基因的真核表达

旨在构建新疆南部4个地方品种(品系)绵羊,即平原型和田羊(HP)、山区型和田羊(HS)、卡拉库尔羊(KL)和多浪羊(DL)的肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达质粒并在真核细胞中表达。从4种绵羊骨骼肌中提取总RNA,逆转录获得c DNA,PCR扩增MSTN后与p MD18-T载体连接构建重组质粒并测序分析,然后将MSTN(HP、HS、DL和KL)基因插入到融合表达载体p EGFP-N1中,构建真核融合表达重组质粒p EGFP-N1-MSTN,在细胞铺满80%时用脂质体法转染到CHO中,观察EGFP与MSTN蛋白在CHO细胞内融合表达的绿色荧光。结果显示,平原型和田羊、山区型和田羊、卡拉库尔羊和多浪羊MSTN的ORF序列都是1 125 bp(不含终止密码子),编码375个氨基酸;与Gen Bank中MSTN序列比较,与田羊(HS、HP)没有差异;卡拉库尔羊有2个碱基差异,造成2个氨基酸变异;多浪羊有6个碱基的差异,造成4个氨基酸变异。成功构建EFGP和MSTN共表达重组质粒并在真核细胞CHO中得以表达。     

ITR缺陷对AAV病毒包装与感染力的影响

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷性DNA病毒,其基因组两端的两个倒转末端重复序列(ITR)是rAAV包装复制所必需的自身结构.ITR容易缺失并影响病毒颗粒的包装和感染力.比较两个ITR完整的和一端ITR缺失的AAV病毒发现,一端ITR缺失的AAV载体质粒包装病毒的效率明显比ITR完整的质粒低.用这两种AAV病毒感染293细胞、HeLa细胞和小细胞肺癌细胞NCI H446细胞,显示两个ITR完整的AAV病毒感染细胞的能力明显比一个ITR缺失的病毒强.说明ITR缺失对AAV病毒的包装和感染力都有明显的影响.因此,筛选两个ITR完整的AAV载体质粒,并稳定其基因组的结构,对提高病毒生产的产量和增强病毒的感染力都有显著的价值.     

生物防治因子

从苏云金芽孢杆菌(Bacilla thuringiensis)菌株LM2分离到2个隐蔽质粒pHT和pHT103o(分别长8.6和15 kb),接到载体质粒pJH 101并用以转化大HB101和枯草杆菌菌株168氨节青霉素或四环素的Luria-成培养基上筛选出转化子。物理图谱上迷     

体内遗传标记成团肠杆菌固氮质粒pEA9

用卡那霉素抗性（Kan^r)基因对成团肠杆菌固氮质粒pEA9进行活体遗传标记。将来自质粒pEA9的3.0kb片段(nif ENX)克隆到pBR322载体中,再将卡那霉素抗性(Kan^r)基因插入到3.0kb的片段中,构建成供体质粒pST5。将该质粒转化到含有待标记质粒pEA9的E.a.339菌株中,然后在AP培养基中消除供体质粒,筛选得到40个失去了pST5并保持卡那霉素抗性的克隆,分析表明它们不是质粒pEA9和pST5的共整合体,而是卡那霉素抗性基因通过两个质粒在nifENX区域内的DNA间的同源重组整合到了质粒pEA9上。     

沈抚灌区广宿主石油烃代谢质粒的分离及鉴定

本研究采用“三亲配对外源分离法”,从沈抚灌区土壤、底泥和水样中共计分离得到8个广宿主（BHR）石油烃代谢质粒,并通过对其进行抗生素抗性检测和抗性遗传标记,将其转移至大肠杆菌(Escherichia coli)EC100宿主中进行操作.不相容性群分析结果表明: pS3-2C、pS4-6G为Inc P质粒;pS3-2G、pW22-3G、pA15-7G为Inc N质粒;pS7-2G 为Inc W质粒;pA23-1G和 pA10-1C为Inc Q质粒.采用PCR扩增已报道的石油烃污染物降解基因的方法初步分析其石油烃代谢功能,质粒pS3-2G、pS7-2G、pA23-1G、pW22-3G和pA10-1C上含有编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)和甲苯单加氧酶基因(touA)的片段;pA15-7G含有编码甲苯双加氧酶和甲苯单加氧酶基因片段;pS3-2C含有编码芳香环羟化双加氧酶、苯双加氧酶和甲苯双加氧酶基因片段;pS4-6G仅含有编码芳香环羟化双加氧酶基因片段.通过宿主范围检测,除质粒pS3-2C外,其余7个质粒均可在变形菌纲(Proteobacteria)α-、β-、γ-亚纲的代表性菌株根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228、大肠杆菌EC100间进行转移并稳定传代.     

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。