猪瘟病毒C株兔脾毒在SK6细胞中的增殖培养及其鉴定

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是猪的最重要传染病之一,给养猪业造成巨大经济损失.传统疫苗C株在猪瘟防制中曾发挥了巨大作用,但由于猪瘟病毒逐渐产生变异,同时使用传统疫苗无法区分自然感染动物和免疫动物,从而使传统疫苗的应用受阻.因此十分必要研制新型猪瘟疫苗.用适宜的宿主细胞培养猪瘟传统弱毒疫苗C株,通过灵敏可靠的方法检测病毒在宿主细胞中的感染,是研究猪瘟病毒C株的一个重要基础环节.     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株 (CSFVC株 )为实验材料 ,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律。找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒 ,并对病毒滴度的测定方法进行了改进 ,发展完善了荧光斑技术 (F PFU)。使用改进的病毒滴度测定方法 ,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测。在原代牛睾丸细胞中 ,接毒后 5d ,几乎所有的细胞都可被病毒感染 ;释放到培养液中有活性的病毒粒子达到 10 5F PFU/mL以上 ,后维持在该水平。对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察 ,并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨。并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验 ,不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解 ,还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)为实验材料,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律.找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒,并对病毒滴度的测定方法进行了改进,发展完善了荧光斑技术(F-PFU).使用改进的病毒滴度测定方法,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测.在原代牛睾丸细胞中,接毒后5d,几乎所有的细胞都可被病毒感染;释放到培养液中有活性的病毒粒子达到105F-PFU/mL以上,后维持在该水平.对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察,并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨.并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验,不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解,还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路.     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中拉殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株（ＣＳＦＶ Ｃ株）为实验材料,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律。找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的ＣＤ株猪瘟病毒,并对病毒滴度的测定方法进行了改进,发展完善了荧光斑技术（Ｆ－ＰＦＵ）。使用改进的病毒滴度测定方法,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行了检测,在原代牛睾丸细胞中,接毒后５ｄ,几乎所有的细胞者可被病毒感染;释放到培养液中有活性的病毒     

猪瘟病毒在PK细胞和MPK细胞中繁殖过程的研究

以猪瘟病毒疫苗Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ株（Ｔ株）为实验材料,研究该病毒株在ＰＫ１５细胞中增殖的基本特性与规律。在ＰＫ１５细胞中,猪瘟病毒Ｔ株在感染后１２ｈ即可检测到子代病毒粒子。接毒后４８ｈ,几乎所有的细胞都被病毒感染;到６０ｈ,释放到培养液中有活性的病毒粒子达到最高峰,为１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ。培养液中的病毒粒子在３７℃半寿期只有３个小时。同时,建立了ＭＰＫ细胞ＣＳＦＶＴ株的感染模式,其ＣＳＦＶ的滴度可达１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ。在此基础上,用抗ＣＳＦＶ包膜蛋白Ｅ２和非结构蛋白ｐ１２０的单克隆抗体显示了病毒在细胞中增殖的部位,进而应用电镜技术观察到成熟的病毒粒子及可能处在不同发育阶段的子代病毒粒子     

应用免疫金银技术检测猪瘟病毒兔化弱毒株感染细胞

在应用免疫金银染色技术成功地对猪瘟病毒弱毒疫苗Thiveral株（CSFV．T株）感染的PK－15细胞进行检测的基础上,通过改进免疫金银反应的条件,进一步提高了免疫金银法的检测灵敏度和特异性。目前已将该技术应用到对猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（CSFVC株）感染细胞的检测,获得较为满意的实验结果。免疫金银染色技术的应用为研究CSFV在细胞中增殖的规律提供更为灵敏的检测手段,并且可望为猪瘟疫苗生产中的滴度测定提供一种简便有效的手段。     

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C-株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK-6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT-PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定.结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性.猪瘟病毒C-株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具.     

禽呼肠孤病毒变异株的分离鉴定

从病鸡肝分离到一株病毒,经电镜检查、理化特性分析、核酸电泳和中和试验等证明它为禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）。该病毒只在鸡胚肝细胞（ＣＥＬｉ）上产生细胞病变（ＣＰＥ）,在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和Ｖ＿（ｅｒｏ）细胞上不增殖,它对热无敏感,Ｍｇ￣（２＋）不能增强其对热的稳定性,其基因组中的４个小节段的迁移率与ＡＲＶＦＤＯ和Ｓ＿（１１３３）株明显不同,表明它是不同于ＦＤＯ和Ｓ＿（１１３３）的ＡＲＶ变异株。     

通过基因组定量研究猪瘟病毒在细胞中的增殖特性

应用间接免疫荧光、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术,分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化3个方面,研究了猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中增殖的特点,用猪瘟病毒石门株感染96孔板培养的细胞,1×102个TCID50/孔,间接免疫荧光检测结果显示感染后8h能检测到被荧光抗体染色的感染细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染后72h,几乎所有细胞均能出现荧光。Real-time PCR结果显示在细胞感染初期的8~24h,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,其拷贝数在感染后72h达到高峰。此外,在感染后8h能检测到病毒基因组负链RNA转录,不过负链RNA在病毒增殖过程中维持在较低的水平。TCID50测定结果表明CSFV的感染滴度增加趋势与基因组类似,在病毒感染8h后能检测到具有感染性的子代病毒,感染滴度在8~20h之间逐渐增长,24~48h之间增长速度稍减慢,在感染后48~52h达到高峰,能在72h之内维持较高的感染滴度。     

携带高滴度猪瘟病毒C株猪睾丸细胞株的建立及蛋白质组学分析

猪睾丸细胞(Swine testicular,ST)广泛用于猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的传代,为了进一步提高ST细胞增殖的CSFV滴度,我们利用有限稀释法克隆出一种稳定携带高滴度CSFVC株的单克隆细胞株(STC).间接免疫荧光实验结果显示,几乎100％STC细胞携带CSFV抗原;且STC细胞中CSFV滴度为106 TCID50/mL,与CSFV单次感染亲本ST细胞的病毒滴度104 TCID50/mL相比,具有更高的病毒产量.为了探究STC细胞持续带毒后细胞内蛋白表达水平的变化,我们通过非标记定量蛋白质组学分析发现541种蛋白表达水平发生明显变化,并选取其中差异显著且与病毒复制或细胞存活相关的两种上调蛋白(GRP94,GRP78)、两种下调蛋白(β-catenin,ISG15)进行免疫印迹验证.本试验成功获得了可以稳定携带高滴度CSFV C株的STC细胞株,并初步筛选了与细胞持续带毒有关的目标蛋白,不仅为简化猪瘟传代细胞苗生产工艺提供条件,也为研究STC细胞持续携带CSFV稳定传代的机制奠定基础.     

Synthesis and antiviral activity of a novel glycosyl sulfoxide against classical swine fever virus

A novel compound—2″,3″,4″,6″-tetra-O-acetyl-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2′,3′,6′-tri-O-acetyl-1-thio-β-d-glucopyranosyl-(5-nitro-2-pyridyl) sulfoxide—designated GP6 was synthesized and assayed for cytotoxicity and in vitro antiviral properties against classical swine fever virus (CSFV) in this study. We showed that the examined compound effectively arrested CSFV growth in swine kidney cells (SK6) at a 50% inhibitory concentration (IC₅₀) of 5 ± 0.12 μg/ml without significant toxicity for mammalian cells. Moreover, GP6 reduced the viral E2 and E^rns glycoproteins expression in a dose-dependent manner. We have excluded the possibility that the inhibitor acts at the replication step of virus life cycle as assessed by monitoring of RNA level in cells and culture medium of SK6 cells after single round of infection as a function of GP6 treatment. Using recombinant E^rns and E2 proteins of classical swine fever virus produced in baculovirus expression system we have demonstrated that GP6 did not influence glycoprotein production and maturation in insect cells. In contrast to mammalian glycosylation pathway, insect cells support only the ER-dependent early steps of this process. Therefore, we concluded that the late steps of glycosylation process are probably the main targets of GP6. Due to the observed antiviral effect accompanied by low cytotoxicity, this inhibitor represents potential candidate for the development of antiviral agents for anti-flavivirus therapy. Further experiments are needed for investigating whether this compound can be used as a safe antiviral agent against other viruses from unrelated groups.     

非洲猪瘟病毒的生物学特性与疫苗研制的难点

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病,是全球养猪业的"头号杀手",强毒株引发的超急性和急性感染死率高达100%。2018年8月ASF首次传入我国,截止2019年6月6日,已有32个省份累计暴发137起疫情,给我国社会、经济构成巨大威胁。ASF疫苗的研制始于20世纪60年代,但均以失败而告终,其主要原因是对ASFV生物学特性缺乏深入的研究。有效控制当前ASF疫情扩散、研制安全有效的疫苗将是我国面临的巨大挑战。本文对ASFV形态与基本结构、传播途径、致病机制、基因组及编码蛋白、入侵机制、免疫逃逸等生物学特性进行了概述,并分析了当前疫苗研制面临的难点,以期为我国有效控制ASF疫情及病原研究提供参考。     

Development of multiple elisas for the detection of antibodies against classical swine fever virus in pig sera

The major immunogenic proteins (Ems,E2 and NS3) of classical swine fever virus (CSFV) (Shimen strain) were expressed in E.coli and purified by affinity chromatography.The recombinant antigens were appl...     

猪瘟病毒Core蛋白核仁定位序列鉴定

黄病毒科病毒核衣壳蛋白的核仁定位在病毒颗粒包装与病毒复制中发挥重要作用。为鉴定黄病毒科的猪瘟病毒Core蛋白核仁定位序列,本研究构建了将Core蛋白、截短突变体和氨基酸位点突变体分别与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP )融合的真核表达质粒,转染至PK15细胞后进行表达和定位分析,结果显示 Core蛋白核仁定位序列为PESRKKL,其关键氨基酸为R76K77,对理解猪瘟病毒Core蛋白结构与功能和为后续研究Core蛋白在病毒复制及颗粒包装中的作用有重要意义。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种毁灭性传染病,给养猪业造成重大经济损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)是一株非常安全、有效的优秀弱毒疫苗,对各年龄和品种的猪都极其安全,同时对不同基因亚型的CSFV均能提供有效的免疫保护。在现地,CSFV和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的现象时常发生,有必要研制针对这两种病毒混合感染的二价疫苗。本研究首次构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组C株,并评价了其在体内外的特性。结果表明,该重组病毒与C株具有相近的体外增殖特征,能够稳定表达Cap蛋白,在家兔体内具有与C株相似的生物学表型,在免疫家兔后10 d,抗CSFV E2抗体全部转阳,然而抗Cap抗体未能转阳。本研究为进一步优化表达PCV2Cap蛋白的重组C株奠定了基础。     

Expression and functional characterization of classical swine fever virus E(rns) protein

E(rns) is an envelope glycoprotein of classical swine fever virus (CSFV) with unusual RNase activity. Recently, E(rns) was found to have a new function of counteracting the beta-interferon (IFN-beta) induction pathway. In this study, wildtype ErnsSM and two mutated E(rns) proteins ErnsH297k and ErnsH346k were expressed in insect cells and purified for RNase activity and function analysis. RNase activity assay in vitro demonstrated that only wildtype E(rns) protein had RNase activity. However, both wildtype ErnsSM and the two mutated E(rns)ErnsH297k and ErnsH346k as exogenous proteins had a block effect on Newcastle disease virus (NDV)-mediated IFN-beta promoter induction.     

猪瘟病毒与宿主天然免疫系统的相互作用

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的一种高度接触性传染病,临床上以出血综合征与免疫抑制为主要特征。它在多个国家流行,给中国乃至世界养猪业造成巨大的经济损失。研究表明,猪瘟病毒感染能够诱导宿主的天然免疫应答,也能通过影响天然免疫效应分子的表达来抑制宿主的天然免疫功能。本文将对猪瘟病毒感染与天然免疫应答及其免疫抑制的现象与机理进行综述。