土曲霉金色变种AT8951菊粉酶的纯化和性质的研究

土典霉金色变种AT8951菊粉酶粗酶液经硫酸铵分段沉淀、DEAE Cellulose DE32离子交换、超滤、Sephadex G-150凝胶过滤和FPLC,获得两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ,经分析型FPLG和PAGE鉴定为单一纯和分析纯。EⅠ分子量为66KD,最适作用温度和pH分别55℃和5.8;EⅡ分子量为56KD,最适作用温度为57℃,最适pH为6.0。EⅠ和EⅡ皆为糖蛋白,多糖含量分别为24.7％和22％,都属于内切酶。本文还对EⅠ和EⅡ的Km值和I/s值,温度、pH、离子对酶活作用的影响等进行了研究。     

青霉胞外菊粉酶的纯化和性质研究

青霉菌（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＳＰ．９１－４）产生的胞外菊粉酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｎｕｌｉｎａｓｅ）粗酶液,经硫酸铵沉淀,超滤浓缩,Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－１００凝胶过滤,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ离子交换柱层析等步骤,得到提纯３０倍的酶Ｅ。酶Ｅ反应时最适ｐＨ４．５,最适温度为５０℃,在ｐＨ４．７～７．６范围内,温度５０℃以下酶Ｅ活性稳定;其活性受Ａｇ＾＋,Ｃｕ＾２＋ＰＣＭＢ强烈抑制。采用     

海枣曲霉β—葡萄糖苷酶的提纯与性质

A beta-glucosidase has been purified to electrophoretically homogeneity from the wheat bran culture of Aspergillus phoenicis by PEG 6000-phosphate biphasic separation, column chromatography on Sephadex G-100, DEAE-Sephadex A-50 and SE-Sephadex C-50. The enzyme showed optimal activity at pH 5.0 and 60 degrees C. It was stable in the pH range of 4.0-7.5 and up to 55 degrees C. The enzyme activity was strongly inhibited by Ag+ and Hg2+. The molecular weight of the enzyme was 118000 as determined by SDS-PAGE and 195000 by gradient-PAGE. The isoelectric point was pI 3.95 as determined by PAGIF.     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag⁺、Hg2+和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋…     

青霉菊粉酶的产生和性质

由淀粉通过葡萄糖异构化生产高果糖糖浆,生产上受到原料的限制。果糖另一种来源是菊粉（Inulin）。菊粉是以β-2,1果糖苷键连接的一种多聚果糖,其末端含有一个蔗糖残基,它作为贮存性多糖大量存在于菊芋（Helianthus tuberosus）、菊巨(chicoryintybus)、大丽花（Dahlia pinnata）等多种植物中,至今尚未得到很好利用。菊粉可通过化学法或酶法水解生成果糖。利用菊粉酶     

毛壳霉内切菊粉酶的纯化与性质

毛壳霉 (Chaetomiumsp .)C34发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE 纤维素 11离子交换层析、Q SepharoseFastFlow离子交换层析、SephacrylS 2 0 0凝胶过滤、PhenolSepharoseTM HP疏水层析 ,得到电泳纯的内切菊粉酶组分 ,纯化倍数为 30 8倍 ,活力回收率为 7 7%。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 6 6kD。菊粉酶的最适pH为 6 0 ,最适温度为 5 0～ 5 5℃。菊粉酶在 5 0℃以下 ,pH5 0～ 8 0时较稳定。Cu2 完全抑制酶的活性 ,Mn2 、Zn2 、Fe2 、EDTA以及NBS(N bromosuccinimide ,N 溴代丁二酰亚胺 )对该酶有很强的抑制作用。该酶对菊粉有较强底物专一性 ,产物主要为低聚果糖 ,也可作用于蔗糖 ,I S值为 2 0。以菊粉为底物时 ,Km 为 0 199mmol L ,Vmax为 115 μmol (mg·min)。     

菊粉酶基因的异源表达、分离纯化及酶学性质

为进一步提高菊粉酶在生物技术领域的应用,研究了来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YX01的菊粉酶性质。通过在毕赤酵母GS115宿主细胞中异源表达该菊粉酶基因(inu),获得了一种外切型菊粉酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量为86.0 k Da。进一步在该菊粉酶上增加6个His标签,采用聚乙二醇(PEG)20 000透析浓缩和Ni-NTA Agarose静态亲和吸附作用的方法,完成菊粉酶的分离纯化,纯化倍数和酶回收率分别为3.6和33.1%。比较发现粗酶液与纯酶的酶学性质相似,且菊粉酶的最适反应温度为60℃,最适p H值为4.62,并测得该酶的Km和Vmax值,以菊粉为底物时,Km和Vmax值分别为80.53 g/L和4.49 g/(L·min);以蔗糖底物时,Km和Vmax值分别为183.10 g/L和20.20 g/(L·min)。金属离子Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+对酶活力具有不同程度的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+和Fe2+的抑制作用最为显著。这些研究为进一步提高菊粉酶在工业化的应用奠定了基础。     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质

华丽曲霉(Aspergillus ornatus)Z58有机磷农药降解酶经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G100凝胶过滤、DEAE52离子交换层析得到了分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为单一组分。凝胶过滤法测得分子量为67 000,提纯倍数为34.2,收率为17.8%。该酶的最适反应温度45℃,最适反应pH72,对热较稳定,并且能在pH6～10范围保持活性。重金属Cu2+对该酶具有明显的促进作用,而SDS对酶具有抑制作用。此酶对所试的有机磷农药都有较好降解作用。     

海枣曲霉β—木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉麦麸培养物抽提液中,通过聚乙二醇６０００－磷酸钾缓冲液双水相分离,相继用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析、羟基磷石吸附层析、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换层析、ＳＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－５０离子交换层析以及最适温度为６５℃,在ｐＨ３．５－６．５之间稳定,酶保温３０分钟时的半失活温度（ｔ１／２）为６８℃。酶的分子量为９     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的提纯与性质

 通过过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双相分离、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、羟基磷灰石层析及SephadexG-100凝胶过滤等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中提纯得到凝胶电泳均一的β-半乳糖苷酶。该酶的最适pH为3.5—4.0,最适温度为60℃(反应15分钟),在pH5.0—8.5之间及60℃以下稳定。在65℃和70℃保温时失活50％的时间分别为27和2分钟。用SDS凝胶电泳法和梯度凝胶电泳法分别测得该酶的分子量为115,000和118,000。薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH4.6。     

海枣曲霉β-木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中。通过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双水相分离．相继用SephadexG-100凝胶过滤、DEAE—Sephadex A-50离子交换柱层析、羟基磷灰石吸附层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、SE—Sephadex C-50离子交换层析以及Sephadex G-50柱层析等提纯步骤,提纯到凝胶电泳均一的β-木糖苷酶。该酶的最适pH为3．5,最适温度为65 C．在pH3．5—6．5之间稳定,酶保温30分钟时的半失活温度(t1-2)为68C。酶的分子量勾95 000,等电点为4．4。Hg2-和Ag+对该酶有强烈的抑制作用。在所测定的底物中．Β-术糖苷酶仅对β-木精苷(pNP-β-Xyl)有强水解作用。其Km值为0．63mmol／L．Vmax为410 umol·min 1．Mg-1。D-木糖为β-木糖苷酶的竞争性抑制剂,其K．值为7．5mmol／L。     

温特曲霉延胡索酸酶的提纯及性质研究

报道经硫酸鱼精蛋白沉淀、硫酸铵分级沉淀和葡聚糖凝胶G-200柱层析,再经冰冻干燥后从温特曲霉F-871菌体中获得延胡索酸酶,纯化倍数为31.70,回收率为36.64％,酶比活性为24.6U/mg。酶学性质研究表明:酶作用最适pH和温度分别为8.0和30℃,稳定pH范围为6.0～8.5,酶在35℃下保温30min后仍残留约90％以上的活力。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag^+、Hg^(2+)和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋粉糖液的产物均为果糖(86.5％)和葡萄糖(13.5％)。     

海枣曲霉木聚糖酶的提纯和性质

通过硫酸铵分段、异丙醇分段、Sephadex G一100凝胶过滤、及DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspetgillu,phornicis)的麦麸培养物抽提液中分离到4个成份的木聚糖酶,分别称之为X一1、X—II、x—III和X—IV。 经7％凝胶浓度的圆盘电泳及薄层等电聚焦分析,x一1、X．IJ和x—Ill皆为均一成分,x—Iv中则仍杂有少量X~llIo X-I的最适pH为4．0,最适温度45℃,在pH 5．0--9．0之间稳定,保温30分钟时的半失话温度t为90℃。X一和x一 的最适 分别为{．及5．,最适温度均为,稳定pH范I 11 IlI pH 50 50~(3画分别为6．0—10．0及7．0--10．0,t1分别为60及55"C。SDS一凝肢电泳法测得x一’、x-r／和x—111的分子量分别为26,500、35。,500及22,000。薄层凝胶等电聚焦法测得三者的等电点分别为{．7、{．4和4．0。在所测定的化学试剂中,Ag’、Hg’’和Mn冲对这三个酶均有较强烈的抑制作用。sDS对x—I活力影响较小,对x_I】和x—Ill则有强烈的抑制作用。脲对X-1的抑制作用大,对X-II和X—Ill的抑制作用小。     

泡盛曲霉植酸酶的酶学性质研究

泡盛曲霉植酸酶作为动物饲料添加剂具有广泛的应用前景。以半固体发酵方式培养泡盛曲霉AS3.324(Aspergillus awamori),并得到纯化的植酸酶。对其酶学性质研究表明:其反应最适温度为50～55℃,最适pH为5.5,在37℃下以植酸钠为底物的Km值为1.05nmol/L,Vmax为2.16μmol/(L.min)。EDTA基本不影响植酸酶活性;Ca2 、Mg2 、Mn2 对植酸酶活性有轻微的抑制作用;Fe2 、Zn2 对酶促反应有显著的抑制作用。对该酶的耐热性研究表明,在较高温度条件处理后,仍有较高残余酶活性,与当今商品化的植酸酶相比,有较强的耐热性。