研究核酸-蛋白质系统的-种凝胶电泳方法

核酸蛋白质相互作用是生命科学研究的中心课题之一,凝胶电泳是研究核酸和蛋白质的常用技术。本文试图介绍一种研究核酸-蛋白质系统的凝胶电泳方法,以及该法在研究基因表达、调控和鉴定、分离DNA结合蛋白中的应用。     

蜜蜂血淋巴蛋白质的淀粉胶电泳

凝胶电泳是区域电泳的一种,系利用凝胶(如琼脂、淀粉及多聚丙烯酰腈胺凝胶)作为电泳的支持物。1955年smithics首先应用淀粉胶电泳来分离人血清蛋自质。一系列的工作证明这种电泳法具有分辨力高、泳动区带清晰等优点。作者等曾采用该方法研究了家蚕Bombyx mori和蓖麻蚕Attacus cynthia rinici发育过程中血淋巴蛋白质成分的变化,发现随龄期的增长,其蛋白成分也相应增加。对于蜜蜂血淋巴生化成分的分析,尤其蛋白质、氨基酸和糖类等的研究近年来已日益受到重视。本实验应用淀粉胶电泳法研究了蜜蜂Apis millefera血淋巴蛋白质的胶电泳特性。 材料和方法 淀粉肢电泳包括有淀粉的部分水解、制胶、血淋巴     

猪几个血清蛋白质位点的等位基因频率在选育中的变化趋势

采用淀粉凝胶电泳测定了杜洛克猪的转铁蛋白(Tf)、前白蛋白(Pa)、血液结合素(Hpx)、铜兰蛋白(Cp)和淀粉酶(Am)多态性,统计和计算了表现型数和等位基因频率,并同1968年测得的基因频率进行了比较,揭示了杜洛克猪几个血清蛋白质位点的等位基因频率在长期选育中的变化趋势,即随着人们有目的地进行选育,这些血清蛋白质位点的等位基因数减少,基因频率向某个等位基因集中,形成优势等位基因。目前的优势等位基因是Tf^B、Pa^A、Hpx^3、Cp^B、Am^8。此外,将杜洛克猪的基因频率同湖南部分地方猪进行了比较,计算了它们的平均杂合度、遗传相似系数和遗传距离系数,并做了聚类分析。     

中华鲟天然群体蛋白质水平遗传多样性

为了阐明我国Ⅰ级珍稀水生保护动物中华鲟(Acipenser sinensis)天然群体的遗传结构和遗传多样性特征,为其资源的监测与保护提供科学依据,采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳技术对中华鲟天然群体进行了蛋白质遗传多态性研究。共研究了15种蛋白质,有4种蛋白无活 性或活性很低,在有活性的11种蛋白中共测得26个座位;在26个座位中,只有1个座位(MDH-1)为多态座位。中华鲟多态座位比例(P)为3.90%,遗传杂合度(H)为0.04,均远 远低于其他鱼类P和H值的平均水平,说明中华鲟在蛋白质水平上的遗传变异较贫乏,与其他鲟鱼类的情况类似。     

α-淀粉酶AmyP中淀粉结合结构域的鉴定

【目的】检测具有生淀粉降解活性的新型α-淀粉酶AmyP是否具有淀粉结合结构域(SBD)。【方法】通过结构域预测和序列分析, 推测AmyP的C端是一个SBD。将这段序列克隆、表达和重组蛋白纯化后, 采用亲和电泳和生淀粉吸附两种方法对重组表达的蛋白进行研究。【结果】AmyP的C端序列是一个新型的SBD, 根据序列特征可以将其划分在碳水化合物结合结构域(CBM) 20家族。该SBD与生大米淀粉的吸附能力最强, 生玉米淀粉次之, 不能与生小麦淀粉、生马铃薯淀粉和生绿豆淀粉吸附。【结论】α-淀粉酶AmyP在蛋白C端具有一个SBD, 有助于理解AmyP快速偏好性降解生淀粉的能力。     

马铃薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及其植物表达载体的构建

目的:克隆马铃薯腺苷酸激酶基因(adk)并进行生物信息学分析,构建反义表达载体。方法:用RT-PCR方法从西南地区马铃薯主推品种“米拉”中克隆adk编码序列,进行生物信息学分析后,反向插入植物高效表达载体pCAMBIA1304 ,构建其反义植物表达载体。结果:克隆到的adk编码序列(stadk)为867bp,编码由288个氨基酸残基构成的多肽。生物信息学分析表明,其亚细胞结构定位于质体,具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ATP-AMP(Ap5A)结合位点和AMP结合位点,蛋白质三维模型具有典型的ADK蛋白立体结构。该蛋白与另一条来源于马铃薯的ADK2序列的遗传相似性最高,在进化树上与杏、苜蓿、水稻的距离最近,与拟南芥的距离最远。将构建好的反义表达载体pCAMBIA1304 -Astadk导入根癌农杆菌菌株LBA4404,获得了工程菌菌株。结论:克隆到stadk基因。生物信息学分析表明,在淀粉合成水平最高的植物中,腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高。获得的工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,为实现淀粉代谢工程奠定了基础。     

马铃薯淀粉合成与降解研究进展

马铃薯是我国第四大粮食作物,其总产量占全国粮食产量的20%。马铃薯是C3作物,其淀粉含量相对较低,这与其淀粉合成和降解过程有关。与马铃薯淀粉合成的相关酶包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)、颗粒结合性淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)、可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthase,SSS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)和淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme,DBE)。α-淀粉酶(α-amylase,Amy)、β-淀粉酶(β-amylase,BAM)、葡聚糖水双激酶(Glucan water dikinase,GWD)、磷酸葡聚糖水双激酶(Phosphoglucan water dikinase,PWD)和酸性转化酶(Acid invertase,AI)、中/碱性转化酶(Neutral/alkaline inverstase,NI)则与马铃薯淀粉降解有关。马铃薯淀粉合成与降解基因克隆对马铃薯品种遗传改良具有重要意义,目前部分克隆的马铃薯淀粉合成与降解基因已在增加马铃薯淀粉含量、淀粉改性和改变淀粉组分方面得到广泛应用。总结了马铃薯淀粉合成与降解酶基因的研究进展,并提出今后研究建议,旨为深入开展马铃薯淀粉改良工程研究提供参考。     

蛋白质芯片

随着人类基因组计划 (ＨＧＰ)顺利实施 ,以生命活动的执行者———蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要[1] ,并构想和发展了快捷、高效、并行、高通量的蛋白质组检测新技术———蛋白质芯片技术。1.蛋白质芯片的基本构成蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。目前蛋白质芯片主要分两种[2 ] :一种类似于ＤＮＡ芯片 ,即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵 ,可特异地捕获样品中的靶蛋白 ,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析 (如图1)。另一种就是微型化的凝胶电泳板。在电场作用下 ,样品中的蛋白质通过芯…     

大肠杆菌冷休克蛋白CspC的分离纯化及部分性质测定

经Sepharose Q Fast Flow阴离子交换层析和Superdex 30凝胶过滤层析,从大肠杆菌(Escherichia coli)细胞内分离纯化了一种小分子蛋白质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度鉴定为单一条带,经质谱分析、N端测序、同源序列比较,确定该蛋白质为大肠杆菌冷休克蛋白CspC.在此基础上,用圆二色光谱测定了其二级结构含量,初步探索了其热稳定性及与单链DNA结合后的构象变化.     

原位化学切割法对油桐尺蠖核型多角体病毒两种相似多肽的比较研究

油桐尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)自1978年分离以来,对其形态结构、形态发生、毒力测定、血清学、理化特性、安全性试验、剂型研究及大田应用等已进行了广泛的研究,其基因组物理图谱也已构建。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究BsNPV蛋白质时发现,多角体蛋白与病毒粒子的一种主要蛋白质的分子量非常接近,     

应用蛋白染色剂考马斯蓝D—250测定蛋白质的方法

在生物化学的研究中,普遍应用Lowry的Folin酚试剂的呈色反应,测定酶制剂的蛋白含量。由于植物材料中常含有酚类化合物,或能与Folin酚试剂起呈色反应的物质,例如有酪氨酸或色氨酸基团的小分子,往往使蛋白质的测定值比实际的高。用者马斯蓝(Coomassie Brilliant Blue)对蛋白质的染色作用,已广泛应用于蛋白质分离的凝胶电泳技术中。近来,Bradford应用考马斯G—250(Coomassie BrilliantBlueG—250)与蛋白质束缚时产生的颜色反应,发展了一种蛋白质的快速测定方法,操作方便,再现性好,测定的浓度范围在0—1000微克/毫升。下面我们除介绍这一方法外,并应用这个方法与Folin酚试剂法,对     

三种花生幼胚蛋白质提取方法比较研究

植物组织(或细胞)的蛋白质提取效率与效果直接影响蛋白质双向凝胶电泳等实验的结果。为探索建立适用于花生幼胚蛋白质(双向凝胶电泳用)提取的最佳条件,尝试了磷酸缓冲液直接提取法、改良的荔枝胚胎蛋白提取法和Trizol(附加)提取法等3种提取方法,根据蛋白提取得率、试剂成本、双向电泳图谱的质量(蛋白质斑点的丰度、分布特点)进行初步评价。结果表明,磷酸缓冲液直接提取法简单但总体效果较差,改良的荔枝胚胎蛋白提取法综合评价最好,与双向凝胶电泳条件更兼容。     

人红细胞酸性磷酸醋酶和醋酶D琼脂糖凝胶电泳法

红细胞酸性磷酸醋酶(EAP）和醋酶 D(EsD）在遗传上是两种重要的多态性酶类〔1］0 研究表明,对于中国人群来说,这两种同工酶类 有着较高的个体识Oil能力（discriminating power, 简称DP值）,其中EAP的DP值为0.51, EsD 的DP值为0.61 E2.31。在为骨髓移植提供遗传标 记证明‘习、群体遗传学、法医学等研究中,是经 常被选用的同土酶。它的遗传表型测定方法有 Hopkison163最初采用的淀粉凝胶电泳法,Grunbaum1s] 报道过的醋酸纤维素膜电泳法,以及sorensen[ 9,和Koster[7)等人选用的琼脂糖凝胶电泳 法。这些方法中,淀粉凝胶电泳法分辨力虽好, 但费时且繁琐。醋酸纤维素膜电泳分型方法简 单、快速,然而采用国产醋酸纤维素膜的分离效 果总不理想。为此,我们参照Rodamlbl方法,应 用国产琼脂糖,建立了EsD的高压琼脂糖电泳 分析方法。同时还设计了EAP同工酶的琼脂 糖凝胶电泳法,所获酶谱清晰,分型准确,较 Sorensen的方法I9]更满意。现将具体方法介绍 如下。     

板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件,从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理,比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法,制备的蛋白质样品经双向凝胶电泳后,在凝胶上呈现的蛋白质斑点的丰度和分布特点。结果表明,两种方法获得的蛋白质主要集中分布在pH4~7的范围内;TCA-丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少。裂解液-TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白质总量较大,通过cleanupkit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染蛋白点用MALDI-TOFMS/MS进行分析,可以得到高质量的肽质量指纹谱。表明该样品制备方法可以满足蛋白质鉴定的要求。     

干旱胁迫对马铃薯叶片生理生化指标的影响

为了验证干旱是限制植物生长发育的最主要因素之一。本研究通过控制土壤含水量的方法,对马铃薯栽培品种"紫花白"进行4 d、8 d、12 d和16 d的干旱胁迫,测定了马铃薯叶片在不同胁迫处理下总蛋白质、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)以及3种抗氧化保护酶:过氧化物酶(POD)、总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)共6个生理生化指标的变化。结果表明,随着干旱胁迫时间的延长,Pro、MDA的含量显著增加,与对照相比增加幅度分别达到378.99%、630.51%;SOD和CAT的活性呈明显的上升趋势,上升幅度分别为121.24%和212.17%;POD活性在胁迫8 d之后开始上升;而总蛋白的含量减少。研究结果说明马铃薯通过一系列的生理生化的变化抵御干旱胁迫,可为马铃薯抗旱研究提供参考。     

木薯栽培种ZM-Seaside和花叶变种块根蛋白组学分析

为研究木薯栽培种ZM-Seaside(高产种质)和花叶变种(低产种质)块根产量差异的原因,从农艺性状和蛋白质组学角度对以上2个种质进行分析,为选育高产木薯品种提供理论依据。试验中采用旋光法测定淀粉含量;硝酸银滴定法测定氢氰酸含量;苯酚抽提法提取蛋白质;双向电泳技术分离蛋白质;Delta2D软件确定差异蛋白质点;质谱技术鉴定差异蛋白质点,结合KEGG数据库将其功能分类;利用Western blot技术对部分差异蛋白质进行验证;String在线软件构建蛋白质互作调控网络。结果显示,ZM-Seaside块根淀粉含量为29.18%,显著高于花叶变种的25.83%;两种木薯鲜薯薯肉氢氰酸含量均低于50 mg/kg,属可食用木薯种质。ZM-Seaside干物率为40.28%,显著高于花叶变种的37.16%。以花叶变种块根的全蛋白质为对照,ZM-Seaside的块根存在39个差异蛋白质点,其中上调表达23个,下调表达16个;经质谱技术成功鉴定到其中28个,其功能涉及到碳水化合物和能量代谢(7个)、分子伴侣(8个)、解毒和抗氧化(2个)、蛋白质合成(1个)、结构蛋白(3个)及未知功能蛋白质(7个)。STRING代谢网络显示:热激蛋白Heat shock protein和分子伴侣Molecular chaperone Hsp90-1互作关系最多,是整个互作调控网络的枢纽。推测这2个蛋白质是影响ZM-Seaside和花叶变种块根产量差异的关键蛋白质,这些蛋白质有可能成为选育高产木薯种质的标记蛋白质。     

一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法

用马铃薯淀粉柱可以直接分离麦芽糖结合蛋白-乳酸脱氢酶辅酶结合结构域融合蛋白,并得到满意的结果.它提纯的程度和吸附量都和商品交联直链淀粉亲和层析柱相比拟,但是成本却要低很多,而且从市场上买来的马铃薯淀粉就可以应用.它可以成为大规模生产的一种工艺路线.     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

晚疫病菌基因组SSR扩增产物两种检测方法的比较与改进

以32份马铃薯或番茄晚疫病菌基因组DNA为模板,分析了琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法对10对SSR引物多态性检测的影响,同时比较了聚丙烯酰胺凝胶电泳两种银染法(常规银染法和快速银染法)的差异。结果显示,聚丙烯酰胺凝胶电泳较琼脂糖凝胶电泳分离效果好,具有更高的多态性检出率,其中快速银染法与常规银染法的检出结果相同,但常规银染步骤繁琐,整个过程要用1-2h,而快速银染只需约15min,且染色背景较浅,条带清晰。聚类分析显示,聚丙烯酰胺凝胶电泳快速银染法可将供试晚疫病菌株分布于更多的聚类组,显示出更高的遗传变异度。可见,聚丙烯酰胺凝胶电泳快速银染法结合SSR分子标记技术,可有效地用于马铃薯或番茄晚疫病菌群体遗传多样性分析。     

不同倍性水稻胚乳蛋白的差异表达研究

以4份同源四倍体水稻和4份相应的二倍体水稻为研究材料, 对其种子内清、球蛋白(清蛋白和球蛋白)、醇溶蛋白和谷蛋白的含量进行了测定, 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析了其特异性。结果表明: 同源四倍体水稻胚乳蛋白各组分含量与相应的二倍体相比, 大部分呈增加趋势; 同源四倍体水稻胚乳蛋白的亚基类型与相应的二倍体水稻基本一致, 仅在全蛋白电泳和清、球蛋白电泳中各发现1条差异条带。研究结果认为: 二倍体水稻经过染色体组加倍之后, 同源四倍体水稻重复基因组在蛋白质水平上的表达结果趋于“二倍化”, 即与二倍体水稻表现出相似的特点, 但在蛋白质表达量上前者往往高于后者。基因组多倍化对同源四倍体水稻重复基因组进化最主要的影响并不是体现在蛋白质结构上的差异, 而是体现在蛋白质表达量上的差异。