雌核发育二倍体鲫鲤杂交克隆品系建立

研究了雌核发育二倍体鲫鲤第2代(G₂)产生的二倍体卵子在无染色体加倍情况下形成第3代(G3)的雌核发育细胞学行为,G₃,G₂×散鳞镜鲤和G₂×四倍体鲫鲤的染色体数目.研究结果表明:(ⅰ)G₂产生的二倍体卵子无需染色体加倍处理,仅在灭活散鳞镜鲤精子激活下,形成了大量G₃.(ⅱ)G₃和雌核发育二倍体鲫鲤第1代(G₁)、G₂一样,也表现出杂交特征,并且都是二倍体(2n=100);G₂与二倍体散鳞镜鲤和四倍体鲫鲤分别交配形成了三倍体(3n=150)和四倍体(4n=200)鱼;(ⅲ)二倍体G₂产生的二倍体卵子在雌核发育过程中,有明显第二极体排出,排除了二倍体卵子源于第二极体保留的可能.另外,还对二倍体鲫鲤产生二倍体卵子的机制进行了讨论.雌核发育二倍体鲫鲤杂交克隆品系建立证明二倍体卵子通过雌核发育形式可形成一个能产生二倍体卵子的新型二倍体鲫鲤品系,二倍体鲫鲤产生二倍体卵子的特殊繁殖方式在生物进化和生产应用方面都具有重要意义.     

异源四倍体鲫鲤的性腺发育研究

采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行了研究。结果表明：异源四倍体鲫鲤的性腺发育程序和普通鲤鲫鱼相似,可以分为6个时期。雌雄个体都能达到性成熟,其中个体性成熟年龄为一周年;雄性个体比雌性个体成熟早,150日龄即可达到性成熟。成熟卵巢的成熟系数为9．25％－15．60％,成熟精巢的成熟系数为1．65％－5．19％。成熟期卵径为1670．4－1780．5μm之间,成熟精子头径为2．3－2．4μm。繁殖期为每年3－5月份。该研究证明异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的,雌雄个体都能达到性成熟。     

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内。精子入卵以来,受精孔立即被受精塞堵住。受精后8min,受精卵出现明显的精子星光,同时进入第二次减数分裂后期,即将排出第二极体;13min时,精子头部开始膨胀,趋向核化;18min时,雌雄原核均已形成,并向胚盘中央靠近;23min时,雌,雄原核开始接触;33min时,雌,雄原核完全融合成为一个合子核;38min时,受精卵开始第一次卵裂,53min后分裂形成两个子核。该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样,具有正常的受精细胞学程序,受精方式为单精受精。     

四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫染色体减数分裂观察

用精巢细胞直接制片法观察了异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫、湘江野鲤精母细胞染色体第一次减数分裂中期配对情况 ;作为对照 ,观察了上述四种鱼肾细胞的有丝分裂中期染色体。在精母细胞第一次减数分裂中 ,异源四倍体鲫鲤同源染色体两两配对 ,形成 10 0个二价体 ,没有观察到单价体、三价体和四价体 ;三倍体湘云鲫精母细胞形成 5 0个二价体和 5 0个单价体 ;红鲫和湘江野鲤精母细胞分别形成 5 0个二价体。肾细胞检测表明异源四倍体的染色体数目为 4n =2 0 0 ;湘云鲫为 3n =15 0 ;红鲫和湘江野鲤分别为 2n =10 0。减数分裂时染色体分布情况与肾细胞染色体检测结果相吻合。具有四套染色体的异源四倍体鲫鲤在减数分裂中只形成 10 0个二价体 ,而不形成 2 5个四价体或其它形式 ,为产生稳定一致的二倍体配子提供了重要的遗传保障 ,也为人工培育的异源四倍体鲫鲤群体能够世世代代自身繁衍下去提供了重要的遗传学证据。三倍体湘云鲫在减数分裂过程中出现二价体、单价体共存 ,同源染色体在配对和分离中出现紊乱 ,导致非整倍体生殖细胞的产生 ,为湘云鲫的不育性提供了染色体水平上的证据     

转基因异源四倍体鲫鲤F1的研究

采用显微注射法将含有鲁鱼β－actin基因启动子的草鱼生长激素基因“全鱼”基因pCAgcGHc转入异源四倍体鲫鲤,然后使其自交得到转基因异源四倍体鲫鲤F1,对150日龄F1体重和体长进行检测,可明显看见转基因异源四倍体鲫鲤F1的生长优势;取F120尾,提取尾鲤基因组DNA,采用合适的引物,PCR方法检测转基因异源四倍体鲫鲤F1是否含有外源生长激素基因,结果150日龄F1阳性率达到90％,且有些雄性个体可以挤出少量精液,而普通150日龄异源四倍体鲫鲤无此现象,文章阐明了通过近交筛选转基因异源四倍体鲫鲤种系具有重要意义。     

转青鱼生长激素基因异源四倍体鲫鲤

生态安全性是转基因鱼走向市场的瓶颈,通过转基因四倍体鱼同转基因二倍体鱼杂交获得不育的转基因三倍体鱼是解决该问题的有效途径之一.本研究构建了青鱼β-actin基因启动子和青鱼生长激素（GH）基因精确连接的＂全鱼＂基因pbcAbcGHc;并采用显微注射法将pbcAbcGHc导入异源四倍体鲫鲤受精卵.对照养殖结果表明,150日龄的转基因异源四倍体鲫鲤原代（P0）的体重及体长明显大于对照组.选择60尾P0代转基因异源四倍体鲫鲤,采用PCR方法检测出外源青鱼GH基因在P0代转基因四倍体尾鳍基因组DNA中的整合率为90%;对20尾雄性P0代转基因四倍体精液样本的PCR检测发现,13个样本具有外源青鱼GH基因的整合.在一尾生长速度显著的P0代转基因四倍体鲫鲤的肌肉、肝脏、肾脏和卵巢组织中可检测到外源青鱼GH基因的转录.本研究成功获得了具有明显生长优势的P0代转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤,为建立转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤纯系和研制不育的转基因三倍体鱼奠定了基础.     

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内.精子入卵以后,受精孔立即被受精塞堵住.受精后8 min,受精卵出现明显的精子星光,同时进入第二次减数分裂后期,即将排出第二极体;13 min时,精子头部开始膨胀,趋向核化;18 min时,雌雄原核均已形成,并向胚盘中央靠近;23 min时,雌、雄原核开始接触;33 min时,雌、雄原核完全融合成为一个合子核;38 min时,受精卵开始第一次卵裂,53 min后分裂形成两个子核.该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样,具有正常的受精细胞学程序,受精方式为单精受精.     

异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记

异源四倍体鲫鲤是从红鲫和湘江野鲤的杂交后代选育出来的,已经形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种群。用异源四倍体鲫鲤(雄性)和二倍体白鲫(雌性)生产的三倍体湘云鲫已经在全国推广应用。因此,如果能够了解异源四倍体鲫鲤的性别分化机制,人为地控制异源四倍体鲫鲤的性别分化,生产出大量的超雄鱼,这对于三倍体湘云鲫的产业化生产有重要的意义。刘少军等对异源四倍体鲫鲤的染色体组型进行了分析,并没有发现异源四倍体鲫鲤有明显的特化的性染色体,这说明通过细胞遗传学研究异源四倍体鲫鲤的性别遗传机制是有困难的。       

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代的RAPD分析

在优化RAPD(随机扩增多态性DNA)检测条件基础上,从134个随机引物中筛选出53个扩增较好且多态性强的引物,对异源四倍体鲫鲤第1代(G1)、第2代(G2)人工诱导的雌核发育二倍体后代群体的DNA多态性及分子标记进行了分析。结果显示,53个随机引物在G1群体和G2群体中检测到的位点数分别为541、511,其中多态性位点数分别为70、52,多态位点比例分别为12.94%、10.18%。两个群体的平均遗传距离分别为0.0732、0.0464。研究表明,经过连续2代人工雌核发育,G2的遗传多样性明显减少,种质进一步纯化。还从53个随机引物的扩增谱带中找到了2个引物(S50、S223)的特异扩增谱带,可以作为第1、2代雌核发育群体间的分子遗传标记。由计算机软件程序构建的分支系统树清晰地反映了两个雌核发育群体及其个体间的相互关系。       

鲤和鲫线粒体(mtDNA)全基因组分析

为研究鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus) mtDNA上的基因分布特征,丰富鱼类mtDNA数据库。本研究通过PCR扩增和测序,获得了鲤和鲫mtDNA基因组序列,经比对分析表明,鲤和鲫的mtDNA序列全长均为16 596 bp,共有13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个D-Loop区。鲤和鲫的mtDNA序列中(A+T)百分含量分别为57.2%和57.1%,其碱基组成均具有一定的A/T碱基偏向性。N-J系统发育树分析表明,鲤和鲫与琵琶湖鮈亲缘关系最近,与达氏深水尾魟亲缘关系最远。本研究揭示了鲤和鲫mtDNA遗传变异特征及基因分布规律,为鱼类遗传资源保护及开发利用提供了参考依据。     

鲤和草鱼杂交四倍体及其回交三倍体草鱼杂种的研究

进行了兴国红鲤♀×草鱼♂的杂交,杂种一代染色体数为142—156,众数值为146—152,系染色体自动加倍的异源四倍体。其外形和习性接近母本,两性均能成熟,雌、雄鱼分别与草鱼进行了回交。以草鱼为母本,杂种一代为父本的回交子代全部为草鱼形,草食性。以杂种一代为母本,草鱼为父本的回交子代一部分象草鱼,一部分象鲤,但草鱼形子代成活率较低,两个回交组合的子代均为三倍体,染色体数98—100,众数值98。1983年获得的杂种一代♀×草鱼♂的鲤鱼形回交杂种,已于1986年性成熟,雌、雄鱼分别与草鱼再次回交,获得了二次回交杂种。测定了红鲤、草鱼、杂种一代及其与草鱼回交子代的乳酸脱氢酶和过氧化物酶的同工酶,它们各有不同的电泳图谱。     

普通番茄四倍体与二倍体杂交的杂种不育性研究

以普通番茄的四倍体为母本与二倍体杂交时,花粉萌发、花粉管生长及双受精过程都正常;对受精的胚珠形态结构观察得知:4天前幼胚和胚乳发育正常,授粉后4天胚乳出现异常开始退化,5天时这种异常现象更明显,第7天胚乳已完全解体。幼胚在胚乳完全解体前发育正常,而胚乳解体后,幼胚也开始解体。所以普通番茄二倍体与四倍体杂交的杂种不育的原因,在于胚乳败育以及胚的死亡。     

异源四倍体鲫鲤群体遗传多样性的RAPD分析

湖南师范大学和湘阴县东湖渔场合作,经过10多年的研究,获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤群体1—7,目前已经繁殖到了F14。异源四倍体鲫鲤具有4套染色体(4n=200),它们的遗传多样性水平怎么样?这是关系到异源四倍体鲫鲤这一新的种质资源能否生存和进化的问题,有必要从分子水平进行深入的研究。随机扩增多态DNA(Random Am-plified Polymorphic DNA,RAPD)是建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记技术8,具有简便、快速、实验成本低等特点,因此被广泛应用于物种的遗传多样性分析、亲缘关系的探讨和系统进化等方面的研究9—15。本研究采用RAPD技术,检测了异源四倍体鲫鲤群体的遗传多样性水平,以期为异源四倍体鲫鲤的人工繁殖、种群复壮以及种质资源保护提供DNA水平上的依据。       

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析

异源四倍体鲫鲤是湖南师范大学鱼类发育生物学实验室和湖南湘阴县东湖渔场在红鲫(♀)和湘江野鲤(♂)的杂交后代中选育出来的四倍体鱼,目前已连续繁殖14代(F3-F16),已形成一个四倍体性能代代相传、遗传性状稳定的四倍体鱼群体,这是世界上唯一人工培育的两性可育的异源四倍体鱼[1—2]。利用四倍体鱼与二倍体白鲫、二倍体鲤鱼杂交,可获得生长快、肉质鲜美、抗病力强等优良性状的不育三倍体湘云鲫、三倍体湘云鲤[3],并已在全国28个省市推广养殖,取得了显著的经济和社会效益。异源四倍体鲫鲤雌性个体产生的二倍体卵子具有两套染色体,在没有染色…     

二倍体和四倍体扬花萝卜的品质特性及抗寒性比较研究

对二倍体扬花萝卜及其同源四倍体萝卜的生长和品质特性及幼苗在低温胁迫下的生理生化特性进行比较研究。结果表明:(1)与二倍体萝卜相比,四倍体萝卜叶片极显著增厚、增宽、增重、叶色加深,叶片中的还原糖和VC含量极显著提高(P<0.01);肉质根的长、直径、重量和小区产量均极显著增加,其可溶性蛋白、还原糖和VC含量极显著提高,而硝酸盐含量则极显著降低(P<0.01)。(2)经过2℃、10 d低温胁迫后,四倍体幼苗的可溶性蛋白、脯氨酸和叶绿素含量大于二倍体,SOD、POD活性大幅度提高且高于二倍体,MDA含量低于二倍体。研究发现,四倍体较二倍体萝卜在叶片和肉质根形态上表现出巨大性,优质高产,且耐寒能力强于二倍体。     

异源四倍体鲫鲤F9～F11染色体和性腺观察

采用肾细胞染色体制片技术,检测了异源四倍体鲫鲤F9-F11代的染色体数目及组型,结果表明：其染色体数目为4n=200,核型公式为44m 68sm 44st 44t,证明F9—F11继续保持四倍体性。观察异源四倍体鲫鲤F9—F11成熟性腺,在这3代四倍体鱼中仍然保持正常卵巢和精巢,分别形成正常二倍体卵子和二倍体精于。在自然环境下,观察了异源四倍体鲫鲤自行产卵受精井产生存活后代过程,证明该四倍体鱼群体在自然环境下能够自行繁殖传代。异源四倍体鲫鲤稳定的染色体数目和正常的性腺结构以及自然条件下的生殖传代行为,说明该异源四倍体鲫鲤已成为一个染色体数目为4n＝200、遗传性状稳定的新型四倍体鱼群体,具备形成新种所需的关键因素。     

鲫鲤杂交鱼自然繁殖了新一代

湖南省湘阴县东湖渔场用鲫鱼作母本,鲤鱼作父本杂交而成的鲫鲤杂交鱼,兼有两亲本的优良性状,个体似特大鲫鱼,一般重在1斤以上,大的可达2斤多,生长速度比鲫鱼快一倍多,抗病力强,肉昧还较鲤鱼鲜嫩,深受市场欢迎。但无法自然繁殖新的一代,不能大     

三倍体鲫鱼--异源四倍体鲫鲤(♂)×金鱼(♀)

利用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体红色双尾金鱼交配 ,制备了 1种新型三倍体鲫鱼 ,并对Ⅰ龄三倍体鲫鱼染色体数目和组型、性腺指数和性腺结构、外形、生长速度等生物学特征进行了系统研究。结果表明 :这种三倍体鲫鱼染色体数目为 3n =15 0 ,核型公式为 33m 5 1sm 33st 33t;在繁殖季节 ,三倍体鲫鱼卵巢和精巢指数明显低于作为对照的红鲫卵巢和精巢指数 ;组织学切片表明三倍体鲫鱼的卵巢和精巢不能产生成熟的卵子和精子 ,证明它们是不育的。三倍体鲫鱼体色为青灰色 ,单尾 ,具有一些介于其父母本———异源四倍体鲫鲤和红色双尾金鱼之间的外形特征 ,如具有 1对肉眼不易观察到的短须 ,侧线鳞式为 31 6 7,背鳍为 18,体高 体长之比为 0 5 ,比湘云鲫的体高 体长之比 (0 4 1)有明显的增加。经过约 8个月的饲养 ,该三倍体鲫鱼平均重量为 35 0g,最大个体达 5 5 0g。在Ⅰ龄鱼中 ,雌性三倍体鲫鱼的个体生长速度快于雄性个体。与三倍体湘云鲫相比 ,该三倍体鲫鱼保留了生长速度快、不育等优点 ,同时新添了体高 体长比值更高、肉质更甜美的特点 ,为 1种有推广前途的新型三倍体鲫鱼     

二倍体和四倍体栽培苦荞的细胞学比较研究

观察和统计了二倍体和四倍体苦荞 (Fagopyrum tataricum)花粉母细胞减数分裂过程 TI、T 时期的异常程度及花粉粒败育性等多个指标 ,并比较分析了二倍体和四倍体苦荞在这些指标上的差异显著性。结果显示 :四倍体苦荞的异常 TI细胞频率、异常 T 细胞频率、TI细胞平均微核数、T 细胞平均微核数及花粉败育率均显著高于二倍体苦荞 ,这表明四倍体苦荞的遗传稳定性和花粉可育性都比二倍体苦荞差。     

二倍体鲫鲤F2产生不同倍性卵子的证据

在检测到鲫鲤F2产生3种不同大小(直径分别为0.13 cm,0.17cm和0.2 cm)类型的卵子基础上,进行了F2(♀)×红鲫(♂)及F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)的交配实验.通过染色体计数和流式细胞仪分析,在F2(♀)×红鲫(♂)后代中获得了四倍体、三倍体、二倍体鱼;在F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)后代中获得了四倍体和三倍体鱼.这两个交配组合后代中出现的不同倍性的鱼类为证明鲫鲤F2能产生三倍体、二倍体和单倍体卵子提供了进一步证据.F2(♀)×红鲫(♂)中雄性四倍体鱼的存在说明在四倍体后代中存在基因型为XXXY的个体.对上述两个交配组合后代的四倍体鱼和三倍体鱼的性腺结构观察表明四倍体鱼是可育的,而三倍体鱼是不育的.作者认为鲫鲤F2能够产生二倍体和三倍体卵子与核内复制机制和生殖细胞的融合有关.