Muted蛋白介导CD63在嗜铬细胞大致密核粒的定位

大致密核心颗粒(Large dense-core vesicles,LDCVs)是一种溶酶体相关细胞器(Lysosome-related organelles,LROs),在细胞受到刺激时快速释放其内含物,从而调节机体生长发育、物质代谢和能量代谢等,维持机体的稳态。Muted蛋白是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(Biogenesis of lysosomal organelles complex-1,BLOC-1)的一个亚基,参与调控溶酶体和多种细胞特异性LROs的生物学发生。四联体跨膜蛋白CD63最初被定位在内体-溶酶体系统,后来发现它也参与部分LROs膜的组成。CD63是否存在于LDCVs尚不清楚,其靶向运输过程是否依赖Muted蛋白也不明确。本研究以肾上腺嗜铬细胞为细胞模型,采用荧光共定位、活细胞追踪和密度梯度离心等实验鉴定CD63蛋白为LDCVs的膜组分,并探讨了其生物学功能。活细胞实验显示CD63-YFP特异性定位在NPY-dsRed标记的LDCVs上,并动态参与LDCVs膜的组成;密度梯度离心实验表明高密度区的CD63与LDCVs的标记蛋白VMAT1共同出峰;Muted蛋白缺乏的小鼠(Bloc1s5基因突变)是一种理想的Hermansky-Pudlak综合征(HPS)小鼠模型, 免疫印迹实验显示该突变体小鼠肾上腺组织中CD63蛋白含量明显减少,暗示Muted蛋白可能参与CD63的分选。以上结果表明CD63是LDCVs的膜成分,CD63在胞内的稳态水平依赖于Muted蛋白,为HPS的病理发生机制提供一定的理论依据。     

正常大鼠肾脏细胞溶酶体膜的构成蛋白

溶酶体是细胞内对其吞噬之物质溶解及消化之主要场所,同时也是细胞自噬作用的主要细胞器。为了进一步了解此细胞器的功能与结构,我们采用免疫荧光标记法,通过5种针对大鼠肝细胞溶酶体膜蛋白的特异性单克隆抗体,对大鼠正常肾脏细胞溶酶体膜蛋白进行了标记,并通过NH_4Cl溶液对溶酶体作了膜膨胀处理,结果显示:(1)细胞内溶酶体膜蛋白是由多种蛋白所构成,其各种蛋白的含量是不同的;(2)所有溶酶体膜蛋白均表达于该细胞器之表面;(3)NH_4Cl溶液能有效地使溶酶体扩张,这将有和于进一步研究溶酶体的结构。     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

酵母亚细胞结构分离效率评估菌株的构建 *

背景: 真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的: 构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法: 通过传统的分子生物学与细胞生物学方法以酿酒酵母为背景构建了亚细胞结构分离效率评估菌株,并进行可行性检测。首先,将酵母各细胞器、自噬体及质膜的标记蛋白进行分组,用不同的蛋白标签分别标记每组蛋白。然后,以标记蛋白-GFP/RFP作为对照组通过免疫荧光法检测蛋白标签对标记蛋白的亚细胞定位是否有影响。最后,通过非连续性密度梯度离心验证该检测菌株能否用来检测亚细胞结构的分离效率。结果: 成功构建了酵母亚细胞结构分离效率评估菌株,该菌株标记了大多数酵母细胞亚细胞结构。挂标签的标记蛋白仍然定位在各自标记蛋白对应的亚细胞结构。非连续性密度梯度离心后,酵母各个亚细胞结构的标记蛋白均可以被检测到。结论: 该酵母亚细胞结构分离效率评估菌株是检测各亚细胞结构分离结果的方便工具,对今后酿酒酵母细胞生物学的研究有潜在的应用价值。     

自噬与疾病

自噬是细胞的一个重要生物学功能。细胞通过对自噬底物的识别、自噬囊泡的形成,再经过与溶酶体的融合,清除老化细胞器以及降解长周期蛋白和异常积聚蛋白。因此,自噬在蛋白质的代谢、细胞器更新以及组织发育中有着重要作用,其功能调控直接参与了机体对细胞稳态的维持     

活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较

真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考.     

自噬对胞内感染病原体的双重作用

自噬(autophagy)是细胞维持稳态的一种机制[1,2].在自噬发生过程中,来源不明的单层膜凹陷形成杯状双层膜的结构,包裹细胞质和细胞器部分,形成有双层膜的自噬体(autophagosome).自噬体随之与溶酶体融合形成自噬溶酶体,其中的细胞物质被溶酶体酶降解,降解后产生的氨基酸可以被细胞重新利用,参与物质的再循环.     

光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用

光激活荧光蛋白是指用特定光照射时, 其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质, 并从多个方面对其应用进行了概括, 包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显微镜中的应用等, 且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。     

光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用

光激活荧光蛋白是指用特定光照射时,其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质,并从多个方面对其应用进行了概括,包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显微镜中的应用等,且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。     

CD63/ME491在植入前小鼠胚胎及延迟着床小鼠子宫的表达

目的 研究肿瘤转移抑制因子CD63/ME491 mRNA和蛋白在植入前小鼠胚胎及延迟着床小鼠子宫中的表达规律,探讨其在胚胎着床过程中的作用以及雌激素对其表达的调节.方法 应用RT-PCR、免疫荧光、免疫组化技术观察CD63/ME491 mRNA和蛋白的表达规律.结果 在植入前小鼠胚胎中均有CD63/ME491 mRNA及其蛋白表达.CD63/ME491 mRNA在桑葚胚及囊胚期表达较丰富,CD63/ME491蛋白表达于各期胚胎细胞的胞膜和胞浆;CD63/ME491 mRNA在延迟着床小鼠子宫均有表达,但从D5到D8呈下降趋势,雌二醇(E2)激活后mRNA的表达显著上升(P<0.05).CD63/ME491蛋白在延迟着床D5弱表达于上皮下基质细胞,D6～8表达不明显,E2激活后该蛋白明显表达于上皮下基质细胞的胞膜和胞浆.结论 1. CD63/ME491在植入前小鼠胚胎中呈动态表达,提示它参与了胚胎的发育过程;2. CD63/ME491在小鼠子宫中的表达可能受雌激素调节.     

原代培养脊髓神经元线状溶酶体与细胞骨架蛋白-纽蛋白关系的研究

目的研究原代培养脊髓神经元线状溶酶体(nematolysosome)的形成与分布及其与细胞骨架蛋白-纽蛋白(vinculin)的关系.方法用细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)及佛波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理原代培养脊髓神经元,用免疫荧光双标记纽蛋白及组织蛋白酶D(cathepsin D)、酸性磷酸酶(ACPase)、电镜细胞化学及共焦激光扫描显微镜方法研究线状溶酶体与纽蛋白的关系.结果在正常对照组神经元,组织蛋白酶D(标记溶酶体)与纽蛋白分布于胞质及突起内;在CD及PMA处理神经元,纽蛋白及组织蛋白酶D的分布呈向心性移动,但集聚的部位不同;电镜酶细胞化学方法显示CD组及PMA组神经元内线状溶酶体均增多.结论组织蛋白酶D及纽蛋白在培养脊髓神经元内协同分布,CD及PMA均可引起二者分布的变化,提示纽蛋白可通过增强细胞内吞体/溶酶体系统活动而使线状溶酶体增加,也可通过促进丝状肌动蛋白聚合而影响线状溶酶体的形成及运动.     

TassC结合过氧化物酶体对早期受染巨噬细胞内的鼠伤寒沙门菌的影响

探讨鼠伤寒沙门菌在感染鼠巨噬细胞早期与细胞器的相互作用。用pTassC-GFP质粒转染鼠巨噬细胞RAW264.7,结合多抗的溶酶体标志物溶酶体相关膜蛋白-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色,以观察标记了绿色荧光蛋白的TassC与溶酶体的关系;用pTassC-GFP和pDsRed2-Perxi质粒共转染RAW264.7细胞,以观察TassC-GFP与过氧化物酶体的关系;用SYTO42标记鼠伤寒沙门菌,感染用pTassC-GFP和pDsRed2-Perxi质粒共转染的RAW264.7细胞,以观察细菌与TassC和过氧化物酶体的关系。免疫荧光显示TassC-GFP不与鼠巨噬细胞RAW264.7中的溶酶体结合,但与标记了红色荧光的过氧化物酶体共定位;感染1 h的RAW264.7胞内SYTO42标记的鼠伤寒沙门菌吞噬泡可招募TassC-GFP和过氧化物酶体。这些发现提示在鼠伤寒沙门菌感染早期过氧化物酶体携带杀菌成分通过TassC介导可参与发挥一定的杀菌作用。     

肝活素转录激活肝源性细胞FOXA2抑制内质网应激

肝活素(hepassocin, HPS)是一种由肝合成和分泌的活性因子，参与肝再生与物质代谢，重组肝活素可以救治小鼠化学性肝损伤和非酒精性脂肪性肝炎，但其具体的分子机制仍需深入研究。前期采用RNA测序技术(RNA-seq)分析发现，HPS敲除小鼠肝中叉头框蛋白A2(forkhead box A2,FOXA2)的表达显著降低。FOXA2是肝内富集表达的重要转录因子，我们推测FOXA2可能是HPS调节肝多种生物学功能的关键靶点。本研究首先通过Western印迹和Real-time PCR证明FOXA2在HPS敲除小鼠肝组织中的表达显著降低(P<0.01),随后在细胞水平证明，重组HPS能显著增加FOXA2的表达(P<0.01)。通过克隆侧翼序列构建FOXA2启动子报告基因，在此基础上通过大片段截断、精细缺失发现FOXA2响应HPS信号的顺式作用元件位于转录起始位点上游-814～-797 bp,为肝细胞核因子6(hepatocyte nuclear factor 6, HNF6)的结合序列。通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay...     

自噬体膜的来源

细胞自噬是指细胞通过自噬-溶酶体(autolysosome)降解变性蛋白聚集物和受损细胞器的过程. 自噬对于细胞内环境的稳态、物质的平衡、胚胎发育以及疾病的发生发挥重要作用. 在电镜下观察,自噬体膜是一个双层脂质膜结构. 细胞中因缺乏除了自噬相关蛋白9 (autophagy-related protein 9,ATG9)以外的自噬体膜相关蛋白,故难以确定自噬体膜的来源. 自噬体膜的来源也因此成为目前自噬研究领域的热点问题. 关于自噬体膜的来源,学术界存在两种观点：一种认为自噬体膜是细胞在自噬体组装位点(pre-autophagosomal structure, PAS)重新合成的;另一种观点则认为自噬体膜来源于细胞已有的某些细胞器(如内质网、高尔基体、内吞体、质膜和线粒体). 该文综述了近年有关自噬体膜来源于细胞已有的某些细胞器的研究进展,旨在为相关领域的研究提供参考.     

GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

膜周蛋白PICK1促进细胞膜上P2Y6受体表达及小胶质细胞的吞噬功能

膜周蛋白PICK1(protein interactingC-kinase-1)参与多种膜受体与膜上蛋白的运输并影响细胞的功能。本研究旨在探索小胶质细胞PICK1与P2Y6受体之间的相互作用是否可改变P2Y6受体在细胞膜上的表达,以及对小胶质细胞吞噬功能的影响。采用小鼠脑内皮层原代培养的小胶质细胞进行免疫共沉淀实验揭示,与PICK1敲除小鼠比较,野生小鼠皮层小胶质细胞内存在PICK1-P2Y6受体相互作用。生物素化、密度梯度离心结合蛋白质印迹实验证明,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞膜表面P2Y6受体表达水平降低。荧光胶珠吞噬实验结合免疫组织化学染色显示,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞对UDP（刺激）引起的荧光胶珠吞噬作用减弱。蛋白质印迹实验显示,与野生型小鼠比较,PICK1基因敲除小鼠小胶质细胞中的Akt 308T磷酸化水平明显降低|使用Akt抑制剂API-2能有效抑制Akt 在小胶质细胞内的（磷酸化）激活及UDP刺激引起的吞噬作用。上述结果表明,敲除PICK1能下调小胶质细胞膜上P2Y6受体的表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能,且这一过程依赖Akt磷酸化修饰。总之,PICK1可促进P2Y6受体在细胞膜上的表达,是小胶质细胞吞噬功能的重要调节子|敲除PICK1可下调P2Y6膜受体表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能。这一结果可加深对小胶质细胞的吞噬功能及机制的认识。     

溶酶体膜上的离子通道

溶酶体是真核细胞中广泛存在的一种囊泡状细胞器,其内部含有多种酸性水解酶,是细胞降解生物大分子的主要位点.在溶酶体膜上也存在多种不同类型的蛋白质,包括离子通道、转运体、结构蛋白、酶等,其中离子通道蛋白由于他们在溶酶体离子动态平衡和跨膜转运、溶酶体膜电位和pH以及细胞营养代谢水平的调控中的重要作用,受到越来越多的关注,多种溶酶体离子通道也被相继鉴定出来.本文简要综述了近年来关于不同类型溶酶体膜离子通道蛋白的研究工作,阐述这些离子通道的特性、功能调控和在溶酶体生理活动中的作用.     

内体—溶酶体运输及其细胞功能

哺乳动物细胞中,内吞作用通过质膜内陷形成囊泡来摄取外界物质,经早内体到达晚内体/溶酶体降解或经再生循环回到质膜。内体运输网络参与细胞一系列重要生命活动,如信号通路调节、细胞器发生以及胞吐作用等。近年来发现Aps、BLOCs、HOPS和ESCRTs等复合体共同参与货物由胞内体到溶酶体或溶酶体相关细胞器的运送。该文主要就这些内体—溶酶体运输系统中重要蛋白复合体的组成和功能进行综述。     

钙库调控的钙通道Orai1体外研究方法的建立

目的:建立钙通道Orai1的体外研究方法。方法:利用脂质体重组技术,将体外纯化的Orai1蛋白重组到脂质体膜上,利用蔗糖密度梯度离心来检测其重组效率及Orai1蛋白在脂质体膜上的结构,并利用钙染料Fura-2检测脂质体内钙离子的释放。结果:成功制备了脂质体及体外纯化了GST-Orai1融合蛋白,蔗糖密度梯度离心结果证明GST-Orai1蛋白成功重组到脂质体上,以及Orai1蛋白以多聚体的形式定位在脂质体膜上。钙离子释放实验证明脂质体内钙离子包装完好,可用于后续Orai1钙通道的功能研究。结论:利用脂质体重组技术建立了一种新的Orai1的研究方法,能够更直接有效地研究其功能及其活化机制。     

原生动物的细胞器（一）

原生动物是真核单细胞动物。它们有与多细胞动物细胞相似的细胞器(cel1 organs)。但由于原生动物细胞适应长久的独立生活,在细胞范围内走过漫长的进化道路,因而发展出了一些在其它细胞中少见或没有的细胞器,名细胞小器(organelles)。本文除简要说明原生动物前一类细胞器的特点外,主要介绍后一类细胞器。原生动物和多细胞的动物的细胞一样,都具有细胞的界膜、膜内的细胞质和中部的细胞核三个主要部分。但为适应保护、支持及运动等需要,其细胞的界膜多非简单的一层单位膜。除变形虫类只具简单的质膜外,多数原生