Cyclophilin A在心脑血管疾病方面的研究进展

亲环素A(eyelophilinA,cyPA)是一种胞质蛋白,属于亲免素家族(Cyclophilins)成员.它广泛存在并且大量表达于各种组织中,高度保守,具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,能够参与多种信号转导途径.亲环素A具有很多生物学功能,包括血管疾病和免疫调节、肿瘤发生等.本文就Cyciophilin A蛋白在心脑血管疾病中的研究进展进行综述.     

小球藻亲环蛋白A的酶活性及过表达拟南芥抗盐性分析

在前期研究中分离到噬碳酸盐小球藻（Chlorella sp.X1）的亲环蛋白基因CsCyp1A（登录号：KY207381）,编码CsCyp1A蛋白是否具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性功能是进一步研究它参与小球藻耐盐生物学过程的基础。通过His标签的pQE-30-CsCyp1A原核蛋白表达载体,经IPTG诱导它的E.coli M15菌株表达融合蛋白,Nitra-柱纯化后获得纯化的30 kDa左右的His-CsCyp1A融合蛋白质,Western杂交检测到HisCsCyp1A蛋白的杂交信号。酶活性分析显示,HisCsCyp1A融合蛋白中生色基团的产生速度明显快于对照,表明CsCyp1A蛋白可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽键的顺反折叠,说明纯化的CsCyp1A蛋白具有PPIase活性。典型的亲环蛋白家族成员具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性,参与折叠和转运、信号转导、免疫调节、细胞凋亡等生物学过程。真空渗入法侵染转化的拟南芥在35S启动子驱动下超表达CsCyp1A基因,耐盐性研究表明它提高了过表达株系对NaCl胁迫的耐性,揭示小球藻CsCyp1A基因的抗盐性功能,它将成为抗逆育种的基因资源。本研究也为探索小球藻亲环蛋白A的抗盐碱胁迫生物学作用和分子育种奠定了基础。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

茧蜂病毒感染Hi5细胞与亲环素A的相关性研究

茧蜂病毒（Microplitis bicoloratus bracovirus,MbBV）属于多分DNA病毒（polydnavirus,PDV）的一种,主要存在于膜翅目茧蜂科寄生蜂中,对于寄生蜂成功寄生宿主起着至关重要的作用。而亲环素A（cyclophilin A,CypA）是一种肽基脯氨酰顺反异构酶,参与免疫反应等多种细胞活动。主要探讨了茧蜂病毒在感染昆虫细胞的过程中,是否与CypA存在相关性。研究结果显示,在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)卵细胞系（High Five,Hi5）培养基中加入茧蜂病毒24 h后,通过PCR可扩增出与病毒基因大小一致的目的片段,表明Hi5细胞已被茧蜂病毒感染。在病毒感染细胞后,CypA的基因转录水平显著升高,其蛋白表达水平也有所增加;当沉默cypa基因或抑制CypA活性后,实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）结果显示,茧蜂病毒基因中的vank86基因转录水平显著下降;而过表达cypa基因,可使vank86基因转录水平上升。研究结果提示,茧蜂病毒在感染昆虫细胞的过程中,可能与CypA存在一定的相关性。     

肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除、表达及酶学特征

【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象,构建基因缺失株及表达纯化该蛋白,为研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考Gen Bank登录的肠炎沙门菌基因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异引物,运用自杀质粒介导的同源重组技术对肠炎沙门菌C50041 slyD基因进行敲除,构建C50041ΔslyD缺失株;原核表达SlyD蛋白,通过α-糜蛋白酶耦联法对其PPIase活性进行测定;利用生物信息学相关软件,分析SlyD蛋白的氨基酸序列及功能域。【结果】PCR鉴定与测序结果证明成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株,其生长特性与野生株基本一致;SDS-PAGE及PPIase活性分析表明,获得了具有生物活性的可溶性SlyD蛋白;生物信息学分析显示SlyD蛋白由FKBP样肽脯氨酰顺反异构酶结构域、分子伴侣功能域和金属结合区域3个功能区域组成。【结论】成功获得了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株和具有PPIase活性的重组SlyD蛋白。     

胞外亲环素A对炎症发生的影响及其抗体在抑制炎症反应中的作用

亲环素A(Cyclophilin A,CypA)是肽基脯氨酰顺/反异构酶家族成员,主要分布于细胞质中,当细胞受到外界刺激时会分泌到细胞间隙,与CD147以配体-受体形式结合,促进炎症细胞的趋化。利用大肠杆菌BL21表达并纯化CypA蛋白,利用该蛋白刺激小鼠的骨髓来源巨噬细胞(BMDM)。实时荧光定量PCR和ELISA试验结果发现,BMDM分泌的IL-1β等炎症因子的表达水平均显著上调,表明胞外CypA具有促进炎症发生的作用。同时以CypA蛋白为免疫原制备多克隆抗体,用于LPS诱导的小鼠急性肺炎的治疗试验。与未治疗组相比,anti-CypA抗体治疗组小鼠的肺组织表面出血点较少,损伤程度减轻,肺组织和血液中IL-1β的表达量显著下降,表明anti-CypA抗体对LPS诱导的炎症具有一定的治疗效果。本研究以胞外CypA-CD147的相互作用为靶点,利用anti-CypA抗体抑制炎症反应,为开发抗炎症药物提供了一种新的思路和策略。     

植物亲环素基因功能研究进展

亲环素属于亲免素家族,具有肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性,在生物界广泛分布,存在于细胞质和各个细胞器中,且在结构上高度保守。植物亲环素是一个多基因家族,除具有一般亲环素的功能外,还在一系列生物学过程中发挥重要作用,如参与胁迫应答、代谢调控及植物的生长发育等。该文主要对近年来国内外有关植物亲环素基因的功能和研究进展进行综述,为今后亲环素研究提供参考。     

斜纹夜蛾ppie基因的克隆及表达载体构建

肽基脯氨酰基顺反异构酶E (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase E, PPIE)是亲环蛋白家族的成员之一,具有肽基脯氨酰基顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase)活性,能与亲环蛋白抑制剂CsA特异性结合。PPIE具有两个结构域:N-端的RNA识别域(RNA Recognition Motif, RRM)和C-端的PPIase活性域。PPIE和其他亲环蛋白一样,具有蛋白质折叠功能。研究表明,哺乳动物细胞中的PPIE能抑制流感病毒复制,能与MLL PHD3相互结合。但昆虫细胞中PPIE的功能研究较少。本文以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,克隆得到ppie基因,通过生物信息学分析发现,斜纹夜蛾ppie基因ORF全长876 bp,共编码291个氨基酸,具有亲环蛋白家族标签:YQGSlFHRIIPDFMCQGG。构建了真核表达载体pIZT/V5-His-ppie,结果证明,构建的真核表达载体能在昆虫细胞中表达,融合蛋白大小为36 kDa左右,与预测大小一致。还通过免疫荧光实验确定,PPIE定位于细胞核中,与前人研究报道一致。本文研究内容将为进一步研究斜纹夜蛾PPIE功能奠定基础。     

三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A (Cyclophilin A, CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp, 3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸, CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MO...     

山黧豆AAE超家族基因的鉴定及LsAAE3的酶活检测

【目的】为研究山黧豆（Lathyrus sativus L.）草酰辅酶A合成酶在三七素（β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸,β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP）生物合成途径中的作用。【方法】研究利用AMP结合结构域隐马尔科夫模型在山黧豆基因组中鉴定了酰基激活酶超家族（acyl-activating enzyme superfamily,AAE）基因,在此基础上,克隆了山黧豆草酰辅酶A合成酶基因LsAAE3,采用多序列比对、原核表达及酶活检测等方法分析LsAAE3基因功能。【结果】结果表明：山黧豆中至少存在22条AAE家族基因;系统发育分析表明,LsAAE3与拟南芥AtAAE3等聚为一支,隶属于酰基辅酶A合成酶家族。基因克隆及序列分析表明,LsAAE3基因cDNA全长为1 566 bp;LsAAE3和AtAAE3的保守结构域类似,均含有AMP结合位点、CoA结合位点、AAE保守结构域。SDS-PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在56 KD左右;利用His标签抗体进行Western blot分析发现,诱导后和纯化的融合蛋白均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为LsAAE3。体外酶活检测表明,LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,其活性发挥依赖于ATP、镁离子。【结论】研究在全基因组水平鉴定了山黧豆AAE超家族基因,并验证了LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,为进一步分析山黧豆LsAAE3在β-ODAP生物合成过程中的功能奠定基础。     

亲免素在植物体内的功能研究进展

亲免素(immunophilin)是一种免疫抑制剂受体,广泛存在于细菌、病毒、真菌、植物和动物等生物体中。植物体内亲免素由FK506结合蛋白(FKBPs)、亲环素(CYPs)和parvulin蛋白构成。大多数亲免素具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性,可以作为分子伴侣指导蛋白质的正确折叠。该文总结了亲免素在激素信号传递、光合作用、胁迫响应及基因表达等方面的最新研究进展,并对今后该领域的研究进行了展望。     

蛋白内含子介导纯化的表达载体的构建及应用

将抗膀胱癌单链抗体(PG)融合在蛋白内含子(intein)的C末端,利用intein的N末端具有的chitin binding domain(CBD)对几丁质柱的吸附特性及intein的自切割活性对PG进行一次性纯化。同时,引入大肠杆菌分子伴侣肽基脯氨酰顺反异构酶(FkpA)与目的蛋白进行共表达及融合表达,以使目的蛋白以可溶形式存在。结果显示,PG融合蛋白对几丁质柱的吸附效率很高,intein的自切割释放PG的效率也较高,但PG仅出现在SDS洗脱液中。FM与PG共表达能显著地提高目的蛋白的可溶性。Intein介导的纯化系统前景远大。     

大花杓兰亲环素基因(CmCyP)的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

家蚕CyPA基因的克隆、表达谱及进化分析

CyP蛋白家族在蛋白质折叠过程中起着重要作用。本研究克隆了家蚕Bombyx mori CyPA基因(BmCyPA),该基因由2个外显子和1个内含子组成,推导开放阅读框编码165个氨基酸,分子量为19.4 kD,等电点为8.79。序列分析表明BmCyPA在不同物种间具有高度的保守性,含有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性位点及与CsA侧链结合的氨基酸,提示BmCyPA可能具有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性和与CsA结合的特性。组织表达谱及EST数据分析显示,BmCyPA在丝腺中高丰度表达。通过对不同物种来源的CyP基因的进化分析,进一步预测了BmCyP基因的功能,BmCyP可能与丝蛋白的正确折叠相关。     

亲环蛋白的结构、细胞定位和生物学功能

亲环蛋白(cyclophilin, CyP)家族是一类广泛存在于原核和真核生物体内, 并在结构上高度保守的多功能蛋白质.该家族属于具有催化含脯氨酸的寡肽底物顺反异构作用的肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, PPIase).CyP通过催化含肽脯氨酰的顺反异构而帮助蛋白质折叠和组装.此外, CyP还起着分子伴侣的作用, 在应激反应中参与调节信号转导途径, 并影响RNA的剪接过程.自最初CyP作为免疫抑制剂环孢素A (cyclosporin A , CsA)的细胞受体被发现以来, 目前大约有130种CyP同源异构体被发现和克隆.CyP家族各成员间不仅分子量不同, 而且在细胞分布及功能上也存在着差异.现从CyP的结构、细胞定位及其功能等3个方面对其作一阐述.     

非洲菊亲环素家族基因GCyP的克隆与生物信息学分析

亲环素(Cyclophilins,CyPs)具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,催化蛋白质折叠过程,并且起着分子伴侣的作用,同时参与mRNA加工和信号转导等生物学过程.本研究在抑制性消减杂交获得表达序列标签(EST)的基础上,通过生物信息学方法获得了非洲菊亲环素家族基因GCyP的cDNA.进而设计特异引物,以非洲菊舌状花为材料,通过RT-PCR扩增并经T-A克隆后测序,获得一条长度为732 bp的序列.该序列经生物信息学分析确认其为GCyP,编码的GCyP含172个氨基酸残基,属于单结构域胞质型亲环素.GCyP序列提交GenBank后接收,登录号为EU1269167.     

亲环素A对冠状病毒复制的影响及其抑制剂的抗病毒作用研究进展

亲环素A (CypA)是一种在生物界中广泛分布,并具有高度保守性的蛋白质,具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性,是免疫抑制药物环孢素A (CsA)的细胞内受体。冠状病毒是具有包膜的、单股正链RNA病毒,目前已知有7种冠状病毒可以感染人类,其中包括致命的SARS-CoV、MERS-CoV以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。已有研究表明,CypA在SARS-CoV、CoV-229E、CoV-NL63以及FCoV等多种冠状病毒的复制中是必不可少的,而且CypA的抑制剂CsA及其衍生物(ALV、NIM811等)对多种冠状病毒具有明显的抑制作用,暗示CypA是潜在的抗冠状病毒药物靶点,CsA这种老药有可能是一种抗冠状病毒的药物。2019年底,新型冠状病毒突然肆虐中国,严重威胁人民生命健康并造成巨大经济损失。鉴于此,文中介绍了CypA对冠状病毒复制的影响,并阐述了其抑制剂的抗病毒作用,旨在为抗新型冠状病毒药物的研发提供科学依据及思路。     

管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液对黄粉虫过氧化氢酶基因表达的影响

为了探究管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生和注射其毒液对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹中过氧化氢酶表达的影响,采用RT-PCR克隆黄粉虫过氧化氢酶基因,利用生物信息学软件分析基因序列结构特性,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达特征,使用试剂盒测定过氧化氢酶活性。克隆获得的黄粉虫过氧化氢酶基因编码阅读框序列长1 620 bp,编码539个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列中含有催化氨基酸位点(His-71、Asn-183和Tyr-393)以及过氧化氢酶家族的3个保守基序：近端活性位点序列(FDRERIPERVVHAKGXG)、NADPH结合位点(XXHQXXXXFXD)和血红素配体结合位点(RXFXYXDXH)。被管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液后,黄粉虫蛹中的过氧化氢酶基因的表达量显著上调,其血淋巴和脂肪体中的过氧化氢酶活性显著升高。研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控黄粉虫过氧化氢酶基因的表达。     

多肽脯氨酰顺反异构酶与阿尔茨海默病

多肽脯氨酰顺反异构酶(简称Pinl)可专一性地使蛋白质一定区段内磷酸化的丝／苏氨酸模体发生顺反异构,从而改变该蛋白质的构型和功能。阿尔茨海默病中发生特征性改变的蛋白质如微管相关蛋白tau、淀粉样前体蛋白(APP)等都含有丝／苏氨酸模体,它们的活性和功能均受Pinl的变构调节。     

植物FKBP基因家族的结构及生物学功能

FK506结合蛋白(FK506 binding protein, FKBP)是一种在生物体中广泛存在、进化上高度保守的组成型蛋白质。除了作为免疫抑制剂FK506受体以外, FKBP还具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)的活性。FKBP在植物中是个大家族, 可作为分子伴侣与一些蛋白相互作用从而调控不同的生化过程。研究表明, 该家族基因在植物的响应胁迫和不同生长发育过程中都扮演着重要角色。最近许多新的FKBP互作蛋白的发现和鉴定表明, FKBP在调控基因表达和光合适应性方面具有广泛的生物学功能。文章对植物FKBP家族的结构特点、分类以及最新的功能研究进展进行了详细的综述。