利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

利用CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链c DNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是细胞间的多功能信号分子,调节生物体的多种生理功能。FGF21作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。为研究FGF21基因对毛囊发育及生长周期的影响及作用机制,本研究通过构建靶向敲除FGF21基因的载体,体外将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到FVB小鼠受精卵中,在小鼠FGF21基因的第1外显子上造成移码突变,从而获得FGF21基因敲除(knock out, KO)小鼠。通过测序鉴定F₀代小鼠基因型,共获得3只FGF21等位基因敲除小鼠(Fgf21 ^-/-);qRT-PCR和Western blotting结果表明,在Fgf21 ^-/-小鼠中未检测到FGF21 mRNA表达和FGF21蛋白表达;经脱毛再生及皮肤组织H&E染色发现,与野生型(wild type, WT)小鼠相比,Fgf21 ^-/-小鼠体重降低、器官组织未出现异常变化、毛发生长速度减慢、毛囊的直径和毛发的密度均减小。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Fgf21 ^-/-小鼠模型,为后续研究FGF21基因在毛囊发育及生长周期中的功能提供了更好的动物模型。     

运用改良的CRISPR/Cas9系统建立HtrA2敲除细胞株

能识别特定基因组DNA序列的核酸酶是基因编辑的重要工具。在单链RNA引导下,来源于一种产脓链球菌的成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)关联蛋白(CRISPR-associated protein 9,Cas9)能够发挥其核酸酶功能对基因组特定序列进行剪切。这种功能依赖于单链引导RNA(single-guide RNAs,sg RNAs或g RNAs)中20 nt的核心靶向序列。在该研究中,作者对已有的CRISPR/Cas9系统载体进行了优化,简化了g RNA表达载体的构建。运用优化后的CRISPR/Cas9系统,我们敲除了HEK293T细胞中HtrA2基因的第一个外显子。这一改进大幅度降低了CRISPR/Cas9技术的使用成本。     

基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。     

CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建猪肌抑素基因敲除细胞系

肌抑素是肌肉增生的负调控因子,为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA,通过电转染方法将其导入猪PK15细胞,经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别,筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序,证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点,带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。     

利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

Efficient and specific generation of knockout mice using Campylobacter jejuni CRISPR/Cas9 system

The Streptococcus pyogenes CRISPR/Cas9 (SpCas9) system is now widely utilized to generate genome engineered mice; however, some studies raised issues related to off-target mutations with this system. Herein, we utilized the Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9) system to generate knockout mice. We designed sgRNAs targeting mouse Tyr or Foxn1 and microinjected into zygotes along with CjCas9 mRNA. We obtained newborn mice from the microinjected embryos and confirmed that 50% (Tyr) and 38.5% (Foxn1) of the newborn mice have biallelic mutation on the intended target sequences, indicating efficient genome targeting by CjCas9. In addition, we analyzed off-target mutations in founder mutant mice by targeted deep sequencing and whole genome sequencing. Both analyses revealed no off-target mutations at potential off-target sites predicted in silico and no unexpected random mutations in analyzed founder animals. In conclusion, the CjCas9 system can be utilized to generate genome edited mice in a precise manner.     

CRISPR/Cas9 system in Plasmodium falciparum using the centromere plasmid

The CRISPR/Cas9 nuclease system is a powerful method to genetically modify the human malarial parasite, Plasmodium falciparum. Currently, this method is carried out by co-transfection with two plasmids, one containing the Cas9 nuclease gene, and another encoding the sgRNA and the donor template DNA. However, the efficiency of modification is currently low owing to the low frequency of these plasmids in the parasites. To improve the CRISPR/Cas9 nuclease system for P. falciparum, we developed a novel method using the transgenic parasite, PfCAS9, which stably expresses the Cas9 nuclease using the centromere plasmid. To examine the efficiency of genetic modification using the PfCAS9 parasite, we performed site-directed mutagenesis of kelch13 gene, which is considered to be involved in artemisinin resistance. Our results demonstrated that the targeted mutation could be introduced with almost 100% efficiency when the transfected PfCAS9 parasites were treated with two drugs to maintain both the centromere plasmid containing the Cas9 nuclease and the plasmid having the sgRNA. Therefore, the PfCAS9 parasite is a useful parasite line for the genetic modification of P. falciparum.     

基于CRISPR/Cas9系统高通量筛选研究功能基因

利用功能缺失型(Loss-of-function)或者功能获得型(Gain-of-function) 策略高通量筛选功能基因,是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)的遗传筛选方法因操作简单、成本相对较低等优势,尽管已经得到了广泛的应用,然而其抑制效果不完全、脱靶效应明显等劣势依然存在。近年来兴起的CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/ CRISPR-associated protein 9)技术能快速、简便、准确地实现基因组敲除等编辑功能,因而成为一种强大的遗传筛选工具;在各种细胞系、人和小鼠及斑马鱼等多种模式动物中,大规模运用该方法筛选功能基因已经取得了巨大成功。本文总结了CRISPR/Cas9技术的特点,将其与传统基因工程方法进行了分析比较,回顾了近期相关的高通量功能基因筛选工作,最后探讨了该技术未来的发展趋势。     

CRISPR/Cas9介导的RPSA基因敲除细胞系的建立及其应用

[目的]利用CRISPR/Cas9技术建立RPSA基因缺失的乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cells,BHK21)细胞系,为开展RPSA调控病毒复制机制研究提供工具;同时,初步探究RPSA对塞内卡病毒复制的影响.[方法]根据GenBank中仓鼠的RPSA基因序列找到产生不同转录本的共同外显子段,...     

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。     

Functional analysis of Bombyx Wnt1 during embryogenesis using the CRISPR/Cas9 system

Recently established, custom-designed nuclease technologies such as the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated system provide attractive genome editing tools. Targeted gene mutagenesis using the CRISPR/Cas9 system has been achieved in several orders of insects. However, outside of studies on Drosophila melanogaster and the lepidopteron model insect Bombyx mori, little success has been reported, which is largely due to a lack of effective genetic manipulation tools that can be used in other insect orders. To create a simple and effective method of gene knockout analysis, especially for dissecting gene functioning during insect embryogenesis, we performed a functional analysis of the Bombyx Wnt1 (BmWnt1) gene using Cas9/sgRNA-mediated gene mutagenesis. The Wnt1 gene is required for embryonic patterning in various organisms, and its crucial roles during embryogenesis have been demonstrated in several insect orders. Direct injection of Cas9 mRNA and BmWnt1-specific sgRNA into Bombyx embryos induced a typical Wnt-deficient phenotype: injected embryos could not hatch and exhibited severe defects in body segmentation and pigmentation in a dose-dependent manner. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis revealed that Hox genes were down-regulated after BmWnt1 depletion. Furthermore, large deletion, up to 18 Kb, ware generated. The current study demonstrates that using the CRISPR/Cas9 system is a promising approach to achieve targeted gene mutagenesis during insect embryogenesis.     

CRISPR/Cas9与心血管疾病

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins)作为一种新型基因组编辑技术,为解释疾病的发生机制和治疗疾病提供了新方法。来自Ⅱ型原核CRISPR系统的CRISPR/Cas9能够通过单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)将Cas9核酸酶靶定到特定的基因组序列发挥作用。已经被成功用来进行基因编辑构建疾病模型,以进行相关领域的功能研究和疾病的治疗。CRISPR/Cas9技术正在迅速的应用于生物医学研究的各个领域,包括心血管领域,它促进了人们对电生理、心肌病、心律失常以及其他心血管疾病的更多了解,已经创建了靶向很多基因的细胞和动物模型,为新一类疗法打开了大门。本综述介绍了CRISPR/Cas9的作用原理、优点和局限性,以及在心血管疾病中的应用进展。