开发中的抗栓剂——水蛭素及其12肽

血栓病是严重危害人类生命与健康的疾病,多年来人们一直在致力于寻找和研制治疗血栓病的有效药物。至今,已有尿激酶、链激酶,组织型纤溶酶原激活剂以及尿激酶原等溶栓药物。与此同时人们也一直在寻找效果更好的抗栓药物。水蛭素就是一种正在开发的抗栓药物。早在1884年就发现了水蛭素,但直到     

美、日研制的人造红血球将进入临床试验

人造红血球有以下优点:在手术和交通事故急需输血时,可免除血型检查直接输血,而且保存期可长达一年,同时不必担心艾滋病、肝炎等病毒的感染。 美国综合医疗企业巴克斯特的人造红血球是用人红血球中的血红蛋白制成的。从将到使用期限的红血球浓缩液中分离、精制成血红蛋白。为延长保存期而进行化学加工,再经加热防     

水蛭素的分子生物学研究

本文从分子生物学的角度简述了蛋白酶抑制剂水蛭素的生物学和临床医学作用,结构特点,结构与功能关系,水蛭素与凝血酶之间的作用方式,以及水蛭素基因的克隆与表达。同时还指出了水蛭素基因的复杂性。水蛭素基因结构的阐明,基因的表达调控,将成为今后研究的重要方向之一。     

重组水蛭素相关肽Hi-lys的表达与纯化(英文)

为开发一种新的有临床应用价值的抗血栓药物,根据水蛭素保持抗凝活性的2 0肽片段,设计并构建了水蛭素相关肽(Hi lys)与天冬酰胺酶C端的融合表达系统.为方便目的肽与融合伙伴的分离,增加了富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)及酸敏感的天冬氨酰 脯氨酸(Asp Pro)位点,获得了表达质粒pED P8 Hi lys.将其转化E .coliBL 2 1,玉米浆培养基(kanr)培养,乳糖诱导获得融合蛋白(AnsB C P8 Hi lys)的高效表达.通过细菌裂解、包涵体洗涤、尿素溶解、乙醇沉淀、酸水解和DEAE 纤维素5 2柱层析纯化获得目的肽Hi lys ,用凝血酶测定法测得其抗凝活性为5 0ATU mg .     

反义抗肿瘤药准备进入临床试验

有关寡核苷酸药物的最新进展是:一所医学专科学校,已申请用其反义化合物,对白血病患者进行试验。在过去几年间,少数生物技术公司及类似的制药公司投资数百万美元研制能通过与mRNA结合阻断专性基因表达的寡核苷酸。尽管使细胞数减少且极昴贵(每克为几万美元),一些研究者预测,十年内它将成为常规临床用药。随着美国食品和药物管理局(FDA)对有关规定的放松和允许进入预临床阶段反义药物的增加,上述预测将成为现实。     

CD_4融合毒素进入临床试验

尽管人们已经不太指望单独应用CD_4来对付HIV(艾滋病病毒),但是,将这种受体与细菌毒素相结合时,也许能真正杀死被HIV 感染的细胞。这种命名为CD_4-PE_(40)的融合毒素正在由Upjohn Co.(Kalamazoo,MI)开发,刚刚进入由国家过敏症及感染病研究所(NIAID)发起的临床试验阶段。北卡罗莱那大学、约翰霍普金斯医院、洛杉矶加州大学医学中心及Tulane 大学都参加这一项“开放标签”(Open-label)的多种剂量安全性和耐性试验。四个单位共将对50名HIV 阳性病人进行试验。患     

水蛭素12肽和尿激酶B链融合基因的构建与表达

尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。经研究证明尿激酶B链(即pro-UK的144-411aa)具有与尿激酶原相似的溶栓性,即对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血副作用小。水蛭素是一种分离自医用水蛭、由65个氨基酸残基组成的单链多肽,能特异、高亲和性地抑制凝血酶的活性,研究证明它各方面的性能都优于肝素。近年来,通过多肽合成方式对水蛭素结构与功能进行了大量研究,确定水蛭素C端12肽是一个具有抗栓功能的结构片段。由于它对凝血酶的高度亲和性,相对低浓度     

抗凝良药水蛭素的研究进展

从水蛭素的分子生物学性质,克隆表达研究,以及临床应用研究等主要方面论述抗凝防栓良药水蛭素的研究进展,并对水蛭的临床应用价值,开发研究成为抗栓领域的一大热点进行了论述。     

尿激酶B链cDNA及其与水蛭素12肽cDNA融合基因的构建

尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。研究证明尿激酶B链,即低分子量单链尿激酶,具有与尿激酶原相同的溶栓特性,对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血的副作用较小,有可能成为一种较为理想的溶栓药物。它的氨基酸序列相当于尿激酶原的144～411aa,国外已通过缺失突变获得了它的结构基因,并在中国仓鼠卵巢细胞中表达成功。由于尿激酶B链分子量较小,且含尿激酶原的酶活功能区,     

重组双功能水蛭素质量标准研究

以生色底物法测定抗凝血酶活性,比浊法测定抗血小板聚集活性,还原型SDS-PAGE测定分子量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后进行肽图分析,其余检测项目按《中国药典》2005版三部规定进行。结果显示,用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》2005版三部的要求。建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组双功能水蛭素产品的常规检定。     

水蛭素在噬菌体表面的展示

水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体pCANTAB 5G8Hir,使水蛭素基因通过接头与噬菌体M13的gp3(197～406)基因片段融合。表达产物在gp8信号肽的引导下到达大肠杆菌周质,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用,说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。     

重组水蛭素HV2的稳定性

重组水蛭素ＨＶ２是凝血酶的特异性抑制剂,是一种非常稳定的蛋白质。温度的升高（１００℃水浴）和ｐＨ（１─１３）的改变不影响其活力,在某些变性剂（８ｍｏｌ／Ｌ尿素、１％ＳＤＳ和６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍）存在的条件下也非常稳定,０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ在７０℃时使其部分失活,只有ｐＨ和温度同时升高其活力才开始下降,ｐＨ１３、８０℃处理１５ｍｉｎ即完全失活,氨基酸组成和活性分析发现失活样品的Ｃｙｓ和Ｌｙｓ被破坏。重组水蛭素ＨＶ２含有一个结构紧密的Ｎ端核心区和一个无序的Ｃ端尾部。其Ｎ端的３个Ｌｙｓ－Ｘａａ键均不被胰蛋白酶水解;胃蛋白酶及糜蛋白酶消化后,分离所得片段,氨基酸组成分析发现Ｎ端核心区依然保持很高的抗凝血酶活性,继续消化２４ｈ,核心区不被进一步降解。     

重组水蛭素的纯化和鉴定

本文报导了化学合成的水蛭素基因在酵母细胞中得到表达,井能分泌水蛭素到胞外。将该菌株培养物的上清液经硫酸铵沉淀和Sephadex G-50过滤后,用DEAE-SephadexA-25进行阴离子交换层析,进而用HPLC反相层析,得到表达产物重组水蛭素。经SDS-PAGE,氨基酸序列分析,抗凝血酶活力分析及血浆滴定实验等方法鉴定,证明该基因表达产物与天然水蛭素HV_2相同。     

重组水蛭素HV2的稳定性

重组水蛭素ＨＶ２是凝血酶的特异性抑制剂,是一种非常稳定的蛋白质,温度的升高（１００℃水浴）和ＰＨ（１－１３）的改变不影响其活力,在某些变性剂（８ｍｏｌ／Ｌ素、１％ＳＤＳ和６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍）存在的条件下也非常稳定,０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ在７０℃时使其部分失活,只有ＰＨ和温度同时升高其活力才开始下降,ＰＨ１３、８０℃处理１５ｍｉｎ即完全失活,氨基酸组成和活性分析发现失活样品的Ｃｙｓ和Ｌｙｓ被破坏。     

水蛭肽基因的克隆及其转化甘蓝

将合成的水蛭肽基因转入甘蓝,构建了水蛭肽的植物表达载体pBOK-L,使用甘蓝的下胚轴和根癌农杆菌的共培养实现转化,再生植株经卡那霉素筛选,检测结果表明所得到的抗性植株均为转基因植株,获得了转水蛭 肽基因的甘蓝植株。     

嵌合水蛭肽的构建与活性分析

血管成形术或动脉粥样斑块破裂等因素所致血管壁损伤而引起的血栓形成过程中 ,血小板的激活和凝血酶的形成起着关键作用 .因此 ,抗血小板和抗凝是治疗血栓的两个重要方面 .血小板膜糖蛋白GPⅡb Ⅲa受体拮抗剂 ,如含Arg Gly Asp(RGD)序列的多肽 ,在临床上已显示了良好的抗血小板