三株芽胞杆菌菌株对松材线虫低温存活与繁殖的影响

为明确细菌在松材线虫生态适应性中的作用,本研究选择与致病相关的松材线虫伴生细菌GD1、马尾松内生细菌GD2以及具有杀松材线虫活性的湿地松内生细菌NJSZ-13为试验对象,测定经这3株芽胞杆菌菌株3个浓度低温驯化10、15和20 d后,在冷冻条件下松材线虫强毒虫株AMA3、中毒虫株AA3和弱毒虫株YW4的存活率和繁殖量。结果表明：低温驯化15 d和20 d后3株菌株对不同毒力线虫的活力影响较驯化10 d后的更显著。在低温驯化15 d、-20℃冷冻处理1 h后,5×10⁶ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为77.22%、83.68%和84.26%,与对照差异显著;5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为75.76%、80.67%和81.50%,与对照差异显著。5×10⁶ CFU/mL和5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD2处理下,与GD1处理组结果相似,菌株NJSZ-13处理组则与菌株GD1和GD2的结果相反。低温驯化15 d、-20℃冷冻处理1 h后,5×10⁶ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的繁殖量分别为7 530、9 317和12 793条/皿,与对照（3 192、3 840和5 823条/皿）差异显著;5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD1处理时,3个虫株的繁殖量均与对照差异显著。而菌株GD2和NJSZ-13处理后,3个虫株的繁殖量均无显著变化。表明不同芽胞杆菌对松材线虫的低温适应性影响存在差异,松材线虫伴生细菌GD1和马尾松内生细菌GD2能增强其低温适应性,而湿地松内生细菌NJSZ-13菌株则相反。     

气候变暖情境下松材线虫在我国的适生区范围

基于历史气象数据(1971—2000),利用CLIMEX软件对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus在我国的潜在适生区进行了预测,结果显示:松材线虫在我国的适生范围广、适生程度高,全国除黑龙江、吉林省无适生区外,其余各省市区均有适生区域,其中约2/3的适生区为高度适生区,覆盖整个南方地区,分布北界达内蒙古通辽地区,西至西藏的日喀则地区;进一步结合英国气候变化研究中心提供的气候变暖情境下未来气候模拟数据TYNSC2.0,利用CLIMEX软件预测出未来30年内(2010-2039)松材线虫在我国的潜在适生区,结果发现同历史气候条件下相比,未来30年内松材线虫在我国的适生分布区将呈现范围增加、适生程度增加、向北扩散的趋势,其中分布北界将到达吉林省西部,分布西界则与历史气候条件下预测结果相差无几。     

低温及其信息素蛔甙对松材线虫睡眠的影响

[目的] 温度作为生态环境的重要组成因子,深刻影响松材线虫的生态分布,本研究旨在探讨松材线虫对温度的响应及其生态适应机制,为松材线虫防治提供依据。[方法] 分别测定了不同龄期松材线虫在25和4℃条件下处理48 h后静息率、糖醇含量和蛔甙的变化,以及蛔甙常温处理18 h后对线虫成虫静息率的影响。[结果] 与25℃对照处理相比,4℃条件下L₂、L₃、L₄和成虫的静息率大幅提升;4℃条件下海藻糖含量显著高于25℃对照处理,约为对照处理的2.32倍,而山梨糖醇、葡萄糖和甘油含量与对照处理均无明显差异;蛔甙测定结果显示,C5、C6和ΔC6含量均下调,C7和ΔC9停止分泌,而C9在4℃条件下开始分泌;生物测定表明,粗提物、C6、C7和C9能大幅增加线虫在25℃条件下的静息率。[结论] 几种蛔甙共同参与了松材线虫低温压力诱导睡眠的调控。     

松墨天牛的全球潜在分布区分析

松墨天牛MonochamusalternatusHope分布在亚洲东部,是松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(SteinerandBuhrer)在亚洲最有效的昆虫媒介,同时也是重要的蛀干害虫。利用CLIMEX模型分析松墨天牛分布区的气候限制因子,并在全球范围预测它的潜在分布区。模型分析结果表明,温度和降水是松墨天牛分布区的主要气候限制因子。温度在30°N以北地区和30°S以南地区主要表现为冷胁迫,在非洲中部、南亚和澳大利亚北部表现为热胁迫。有效积温不足可能是限制松墨天牛向北扩散的主要原因。降水在中国西北地区、非洲中北部、澳大利亚中部和西部与美国西部主要表现为干胁迫。降水量对分布区范围影响不大。预测结果表明,松墨天牛的全球潜在分布区远远大于实际分布范围。松墨天牛在东半球的潜在分布区包括亚洲东部和南部地区、地中海沿岸、非洲的中部和南部以及澳大利亚的东部和南部,在亚洲热带的潜在分布区1年3代,地中海地区1年1代,非洲1年2～3代,在澳大利亚主要1年1代。松墨天牛在西半球的潜在分布区主要集中在美国南部和东部沿海地区,中美洲以及南美洲的广大地区,美国主要1年1代,中美洲1年2～3代,南美洲主要1年2代。     

不同致病力松材线虫和拟松材线虫种群繁殖对温度的响应

为探讨松材线虫Bursaphelenchus xylophilus和拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus在菌食和植食阶段的种群繁殖力对环境温度的响应及其与种群致病力的关系,本研究对不同致病力的松材线虫和拟松材线虫,通过单异活体培养(菌食)和接种寄主黑松(植食)两种方式,探讨了不同温度条件下线虫种群孵化率、繁殖量和后代性比等繁殖参数的变化情况。结果表明,在单异活体培养时,供试的松材线虫强毒和弱毒虫株以及拟松材线虫有毒和无毒虫株在25℃下均具有最高的卵孵化率;不同致病力的松材线虫和拟松材线虫种群具有不同的最适生长温度,松材线虫强致病力虫株ZJ在35℃出现最大繁殖量,弱致病力虫株YW4在30℃下繁殖最多,而拟松材线虫无致病力虫株JNL10和有致病力虫株15#则在25℃下繁殖量较大。但总体来看,在25～35℃下,松材线虫ZJ虫株和YW4虫株繁殖量无显著性差异,而拟松材线虫JNL10虫株和15#虫株的繁殖量具有显著差异。在寄主体内,15～20℃时松材线虫ZJ虫株和YW4虫株繁殖量无显著性差异,25～35℃时,松材线虫ZJ虫株的繁殖量明显高于YW4虫株;而在各个温度下,拟...     

松材线虫的天然毒素研究进展

概述了松材线虫病的现行防治措施及存在问题,介绍了植物源和真菌源天然毒素毒杀松材线虫的研究现状及研究中遇到的问题,指出天然毒素在未来松材线虫病生物防治中的研究方向。     

节丛孢属丝孢菌对松材线虫和拟松材线虫的捕食

利用节丛孢属捕食线虫真菌的8个种,11个菌株,对松材线虫（Bx）和拟松材线虫（Bm）进行了捕食力的测定。结果显示节丛孢属真菌对这两种线虫的捕食能力既存在种间差异,也存在同种不同菌株间的差异。指状节丛孢的3个菌株Ad－1,Ad－2,Ad－3菌株对两种线虫均表现出较高的捕食率,接川7d后对Bx和Bm的捕食率分别达到了98．08％,91．16％,86．3％和96．28％,90．45％,85．38％;同一菌株对松材线虫和拟松材线虫的捕食没有选择性。此外,通过对松材线虫和拟松材线虫繁殖真菌的筛选实验,肯定了利用拟松材线虫代替松材线虫进行生防菌株筛选的可行性。     

基于MaxEnt模型预测四川省松材线虫的潜在适生区

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是我国重要的林业检疫性有害生物之一,由其引发的松材线虫病已造成巨大的经济损失,严重阻碍了林业的健康发展。研究并明确松材线虫在四川省的潜在适生区,对四川省有关部门制定该病害的早期监测、预警及防控具有一定的参考意义。本文基于2009—2018年四川省林业有害生物普查数据中松材线虫病和松墨天牛Monochamus alternatus的实际地理分布数据(松材线虫病:n=208,松墨天牛:n=803)及19个环境变量数据,利用MaxEnt模型和Arc GIS对松材线虫在四川省的潜在分布区进行预测,并用ROC曲线分析法检测模型模拟精度、用刀切法检测变量的重要性及其适宜值。结果表明:松材线虫在四川省的潜在最佳适生区主要分布在宜宾市、广安市、达州市、自贡市、西昌市,以及乐山市和眉山市的交界区,面积为36 541 km^2;影响松材线虫分布的主要环境变量为最干季均温(适值范围1. 5～8. 0℃,最适值6. 4℃)、季节性降水变异系数(适值范围22. 5%～34. 0%,最适值34. 0%)、最冷月最低温(适值范围0. 4～2. 5℃,最适值1. 9℃)、海拔(适值范围250～5 500 m,最适值450 m)、年温差(适值范围5. 9～9. 1℃,最适值5. 9℃)和年降水量(适值范围64～135 mm,最适值68 mm)。     

松材线虫近交系培育及繁殖力比较

近交系的培育是研究动物遗传学特性的基础。为了研究外来入侵种松材线虫的遗传学基础,选择了中国浙江舟山松材线虫种群和美国宾夕法尼亚州松材线虫种群为研究对象,培育了近交系,并比较了近交系培育前后繁殖力的差异。结果表明:美国宾夕法尼亚州松材线虫种群近交系培育得到8个株系,中国浙江舟山松材线虫种群近交系培育得到4个株系,连续近交对松材线虫的繁殖力未造成显著影响。其中,在近交系培育前后,中国浙江舟山松材线虫种群株系群体繁殖力均优于美国宾夕法尼亚州松材线虫种群。此近交系的培育为进一步研究松材线虫入侵的遗传机制奠定了基础。     

松材线虫和拟松材线虫体内细菌的透射电镜观察及分离鉴定

【目的】松材线虫是松树萎蔫病的病原,拟松材线虫在形态等方面与松材线虫极其相似。关于两种线虫与细菌的研究多集中于体表伴生细菌。本文要揭示松材线虫和拟松材线虫体内是否存在细菌。【方法】对松材线虫和拟松材线虫进行透射电镜观察;并采用1%升汞和抗菌素混合液对两种线虫虫体进行体表消毒后研磨,制备悬浮液涂布NA平板;通过生理生化测定和16S rDNA序列分析鉴定细菌种类。【结果】松材线虫和拟松材线虫透射电镜照片显示在两种线虫肠道内均发现细菌;体表无菌的松材线虫和拟松材线虫共分离到3株体内细菌;这3株细菌分别属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和爱文氏菌属(Ewingella)。【结论】松材线虫和拟松材线虫体内均存在细菌;这些细菌对这两种线虫可能具有一定的生理生态作用。本文是松材线虫和拟松材线虫体内存在细菌的首次报导。     

一种捕食线虫性真菌的鉴定及生物学特性分析

【背景】松材线虫病是一种对林木危害严重的森林病害,而捕食线虫性真菌可以利用其捕食器官捕食松材线虫,从而实现对松材线虫病的有效防治。【目的】鉴定分离出一株捕食线虫性真菌并探究其最适生长和产孢条件,为松材线虫的生物防治提供一定的参考依据。【方法】使用ITS2、RPB2和TEF1-α序列对该菌株进行分子生物学鉴定,同时结合其形态特征确定其具体所属种属。观察该菌株在不同温度、pH和营养条件下的生长状况及变化规律,明确其具体的生物学特性。【结果】形态学鉴定结果及分子生物学鉴定结果表明该捕食线虫性真菌为强力节丛孢(Arthrobotrys robusta)。该菌株最适生长和产孢条件有所不同。最适生长条件为28 ℃、pH 10.0-11.0、玉米粉琼脂(corn meal agar, CMA)培养基、碳源为淀粉、氮源为KNO₃。最适产孢条件为30 ℃、pH 8.0、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基、碳源为淀粉、氮源为蛋白胨。【结论】该捕食线虫性真菌为强力节丛孢,对不同环境具有较强的适应能力,在各种环境下除部分极端环境外均能良好生长,对松材线虫具有良好的生防潜力。     

携带与非携带松材线虫的松墨天牛miRNA表达谱比较分析

【目的】松墨天牛是松树的重要蛀干害虫,也是林业重大外来入侵种松材线虫的媒介昆虫。虽然松墨天牛和松材线虫互作的化学生态和分子进化机制受到人们的广泛关注,但miRNA等表观遗传因子在天牛—线虫互作中的作用未见报道。【方法】使用illumina HiSeq 2000平台进行miRNA高通量测序,得到4个携带线虫的天牛miRNA库和4个未携带线虫的天牛miRNA库。此外,对鉴定出的miRNA进行了差异表达分析,并对这些miRNA的靶基因进行了GO注释和KEGG通路富集分析。【结果】在携带线虫的天牛表皮、脂肪体、中肠和气管样本中分别鉴定出780、802、617和762个miRNA;在未携带松材线虫的天牛的不同组织样本中分别鉴定出784、723、713和837个miRNA。在携带松材线虫的松墨天牛中,某些已知miRNA表达量会显著升高,如miR-14、miR279和miR-312等。差异表达miRNA的功能大多指向代谢、免疫等方面。【结论】miRNA在松墨天牛和松材线虫互作中起着重要的调控作用。     

植物根际益生细菌代表性菌株贝莱斯芽孢杆菌FZB42对松材线虫的抑杀性

[目的]由松材线虫导致的松树萎蔫病是松树的毁灭性病害,也是我国最主要的林业病害之一.本研究测评了在农业上广泛使用的、我国微生物肥料行业主要菌种资源之一——贝莱斯芽孢杆菌,对松材线虫的潜在抑杀性能.[方法]选用贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42为材料,测定对不同条件下的菌液上清、不同菌株的菌液上清、细菌素plantaz...     

杀松材线虫细菌的分离、鉴定及其培养条件研究

为了对松萎蔫病进行安全、无污染的生物防治,从青岛大学校园内采集的样品中分离出120株菌。采用浸渍法从中筛选出1株具有较高杀线虫活性的细菌G8-1。杀线虫活性测定结果表明,该菌株发酵上清液48 h后的杀线虫率为90.81%。通过16S rRNA的序列分析,将其鉴定为Flectobacillus rhizosphaerae。通过单因素分析法和正交实验对该菌株的培养条件进行研究,确定最佳培养条件:最适初始pH为8.0,最适培养温度为35℃,最佳接种菌龄为9 h,最佳培养时间为3 d,菌株G8-1发酵上清液的杀线虫率可达到96.31%。对菌株产生的活性物质的稳定性进行初步分析,结果表明该菌株的活性物质都具有较好的热稳定性,并且在弱碱性条件下具有较高的杀线虫活性稳定性。本研究为松材线虫的生物防治提供参考。     

马尾松叶际细菌多样性及其杀松材线虫活性

【目的】分析马尾松叶际细菌种群多样性,挖掘其菌株资源;获得具有杀松材线虫活性的菌株,明确其分类地位,为松材线虫病的生物防治提供菌株资源。【方法】通过平板分离培养法从福建宁德古田、霞浦及三明尤溪的马尾松植株上分离叶际细菌,通过菌落形态特征、16S rD NA PCR-RFLP对供试菌株进行分类;采用离心管培养法测定叶际细菌的杀松材线虫活性,通过生理生化特性测定、16S rDNA基因和gyrB基因序列分析明确拮抗菌株的分类地位。【结果】从福建宁德古田、霞浦及三明尤溪的马尾松植株上分离纯化获得141株马尾松叶际细菌,根据菌落形态特征将其分为9类,扩增获得的16S rD NA经HaeⅢ和MspⅠ酶切后分别有9和11种图谱类型,将2种酶切图谱组合后,在100%相似水平下,供试菌株共有19种图谱类型。以NB培养基或无菌水为对照,松材线虫的48 h校正死亡率为指标,经测定具有不同程度杀线虫效果的菌株有120株,占细菌总数的85.11%;以NB培养基为对照,松材线虫校正死亡率大于50%的菌株有11株,占筛选总数的7.80%,其中杀松材线虫效果最好的菌株为GT10,其48 h杀线虫率为92.56%;该菌株为革兰氏阳性菌,菌体杆状、周生鞭毛,可利用甘露醇和柠檬酸盐,硝酸还原反应和V-P试验呈阳性,系统发育树分析结果显示,菌株的16S rD NA基因和gyrB基因的序列均与蜡样芽胞杆菌模式菌株ATCC14579聚为一支,将菌株GT10鉴定为蜡样芽胞杆菌。【结论】马尾松叶际细菌具有丰富的多样性,其中蜡样芽胞杆菌菌株GT10具有较高的杀松材线虫活性,具有防治松材线虫病的潜力。     

松材线虫galectin-1基因的克隆、原核表达和表达模式分析

【目的】galectin-1是凝集素的一种,广泛存在于各种生物体内,在生长发育、免疫调节方面起重要作用。本研究克隆和表达了松材线虫的galectin-1蛋白,并分析了各个龄期的表达量。【方法】设计引物,扩增松材线虫的galectin-1基因,使用双酶切的方法连接p ET-28a载体和目的基因,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆;在不同温度下,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检验蛋白表达情况;采用RT-PCR技术检验松材线虫各个龄期galectin-1基因的表达情况。【结果】由SMART和Predict Protein软件分析可知,该蛋白有2个结构域,并且主要由无规卷曲和β折叠构成;生物学信息分析显示,松材线虫的galectin-1与小卷蛾斯氏线虫的相似性更高;与日本血吸虫相比,线虫能很好地聚集在一个分支上。Western blot检测纯化蛋白大小与查询所得蛋白分子质量一致。RT-q PCR结果显示,以繁殖型2龄松材线虫(L_2)为对照,galectin-1基因在繁殖型3龄(L_3)、繁殖型4龄(L_4)、扩散型3龄(L_(Ⅲ))和扩散型4龄(L_(Ⅳ))松材线虫中的表达量高,尤其是在LⅢ中的表达量最高;雌雄成虫没有显著性差异。【结论】松材线虫的galectin-1基因在p ET-28a原核表达系统中呈可溶性表达,在不同龄期的表达量有差异。本研究为进一步研究松材线虫的galectin-1基因奠定了基础,为松材线虫的防治提供了新的方向。     

松材线虫潜伏侵染阶段对马尾松内生细菌群落的影响

【目的】本研究旨在研究松材线虫在潜伏侵染阶段对马尾松内生细菌群落的影响,探寻松材线虫潜伏侵染阶段的标志性内生细菌和松材线虫病可能的发病机制,为松材线虫的潜伏侵染识别和松材线虫病防治提供基础。【方法】采用16S高通量测序技术分析马尾松内生细菌群落,比较携带松材线虫的马尾松与健康马尾松之间的内生细菌群落差异,并分析与松材线虫含量的相关性。【结果】松材线虫潜伏侵染的马尾松内生细菌群落与健康马尾松相比差异显著,物种丰富度显著增加,均匀度和多样性无显著变化。内生细菌群落网络分析中,最大Cluster中物种数减少,Cluster数目增加;相关关系数目减少,其中正相关比例升高。携带松材线虫的马尾松中,丰度最高的菌属为伯克霍尔德氏-卡瓦列罗-副伯克霍尔德氏菌属,其丰度也显著高于健康马尾松;最核心的菌属为交替赤杆菌属。分枝杆菌属在携带线虫松树中丰度显著增加,与线虫含量显著正相关,同时在内生细菌群落中有相对核心位置。健康松树中丰度最高的菌属为产碱杆菌科未分类属,在携带线虫松树的样品中其含量显著降低。微小杆菌属在2类样品中的差异不显著,但在健康马尾松内生细菌群落中具有最核心地位,并与松材线虫的含量显著负相关。【结论】被松材线虫潜伏侵染的马尾松,其内生菌群因为松材线虫侵染带来的压力而被扰动,导致内生菌群落复杂性和物种丰富度的增加。在变化的内生菌群落中,伯克霍尔德氏-卡瓦列罗-副伯克霍尔德氏菌属和交替赤杆菌属可能在松树抵抗松材线虫病的过程中发挥协助作用。分枝杆菌属可能参与协助松材线虫危害松树。产碱杆菌科和微小杆菌属对于健康马尾松具有重要意义。     

丝状真菌杀松材线虫代谢产物研究进展

松材线虫病是破坏我国森林生态系统最为严重的病害,具有极强的传播性和破坏性,防治此种病害迫在眉睫。基于对物理和化学方式防治松材线虫的研究,对环境友好度最高的生物防治具有更广的研究前景。丝状真菌及其次级代谢产物,来源于自然,与传统的化学杀线虫药剂相比,对环境影响较小,针对松材线虫的致死作用更为专一,因此,从丝状真菌的次级代谢产物中分离获得杀松材线虫活性产物并测定其结构和活性,对于松材线虫病的防治具有重要意义。本文对丝状真菌产生的具有杀松材线虫活性产物的结构、活性展开综述,发现近二十年共有57个活性产物被发现,且结构多种多样,活性差别较大,为了更好地开展此领域的研究,本文对所有产物的结构和活性进行了系统总结,最后又对该领域的研究进行了总结和展望,以期对松材线虫病的生物防治和丝状真菌杀松材线虫次级代谢产物的深入研究提供参考。     

Molecular cloning and characterization of a calreticulin cDNA from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus

The cloning and characterization of a cDNA encoding a calreticulin from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus is described herein. The full-length cDNA (Bx-crt-1) contained a 1200 bp open reading frame that could be translated to a 399 amino acid polypeptide. The deduced protein contained highly conserved regions of a calreticulin gene and had 66.2–70.1% amino acid sequence identity to other calreticulin sequences from nematodes. RNAi, RT-PCR amplification, and southern blot suggest that Bx-crt-1 may be important for the development of B. xylophilus.