医药其它

921368由变铅资链娜菌分泌抗生蛋白链菌素〔俄〕/Bol。-tin,A.P.…1 Antibiot.Khimioter一1091,36(6)一s~12[译自DBA,i。。1,10(25),91一10410〕 构建T一种bireplieon载体质粒pVGi4o,其中含有编码dagA基因信号肤的表达单位。将质粒pAPS中的阿维T链霉菌(“,e尹￡o仍犷eesa”￡d‘-耐落、抗生蛋白链菌素基因克隆到质粒pVG140上,获得重组质粒p VG141和pVG142。用它们转化变铅青链霉菌(5.1畜公落da.‘)Tk64,以硫链丝菌肤抗性为基础,选择含有质粒的克隆。重组菌株能够分泌抗生蛋白链菌素。检测了培养基成分和碳源对该抗生素的影响。5.1…     

抗生素和干扰素

940623用链霉菌分泌表达系统生产抗细菌肚“aPidaeci-n”〔英〕/Maeno,M.…/Biosei.Bioteehnol。Bio。hem一1993,57(7)一1206~1207〔译自DBA,1993,12(19),93一10550〕 为了获得链霉菌枯草溶菌素抑制素(SSl)’-ap记aecin融合蛋白,构建了一种表达载体质粒pjsZos一d一EAPIM,并在变铅青链霉菌菌株66中表达。融合蛋白的产量为72m幻1培养基。这种融合蛋白含有551和加在apidaeein基因前头的具Met密码子的apida“cin,起CNBr切割位点的功能。用硫酸钱沉淀、离子交换层析和反相HPLC法纯化产物,并用CNBr切割分离apidaecin(一种抗菌肤,具有1…     

医药其它

921792利用变铅,链.菌生物转化洋地黄毒试元【英〕/Dahiya,J.5.了Indian J.Mierobiol一1991,31(3)一251~256〔译自DBA,1991,20 (21),91一12157〕 将悬浮于Tween一80的洋地黄毒贰元(1g)加人到4日龄的变铅青链霉菌生长培养基中,于26~30℃下温育21天。温育后,离心和浓缩培养液,然后用氯仿一甲醇(3:1)抽提。对抽提液进行硅胶TLC,并经Nueleosil5Cis上的HPLC分离和纯化产物。收集到6种级分,对其进行MS、PMR和CMR光谱分析。经鉴定这些物质为洋地黄毒贰元、17一夕一H一洋地黄毒贰元、3一epi一17一声一洋地黄毒贰元、17一声一H一aeovenos…     

缺失氨肽酶N的变铅青链霉菌的构建和鉴定*

用PCR方法扩增变铅青链霉菌 (Streptomyceslividans)TK2 4氨肽酶N基因 ,体外插入卡那霉素抗性基因进行失活 ,然后利用不含链霉菌复制起点的重组质粒 pPEPN KAN进行同源重组 ,获得了氨肽酶N缺失的菌株PEPN- 。突变株的胞外氨肽酶N活性与原株基本相同 ,而胞内氨肽酶N的活性明显低于原株 ,为原株的 42.5± 5.7%。     

缺失氨肽酶N的变铅青链霉菌的构建和鉴定

用PCR方法扩增变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24氨肽酶N基因,体外插入卡那霉素抗性基因进行失活,然后利用不含链霉菌复制起点的重组质粒pPEPN-KAN进行同源重组,获得了氨肽酶N缺失的菌株PEPN-.突变株的胞外氨肽酶N活性与原株基本相同,而胞内氨肽酶N的活性明显低于原株,为原株的42.5±5.7%.     

变铅青链霉菌与放线菌噬菌体φHAU3相互关系的研究

变铅青链霉菌ＺＸ１,是由变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变后产生的一株修饰基因突变株,与其亲本ＪＴ４６相比,ＺＸ１除了与ＤＮＡ降解有关的基因发生了突变（Ｄｎｄ－,即该突变株的ＤＮＡ在含有Ｆｅ２＋的缓冲液中电泳不受到降解,而野生型变铅青链霉菌在同样条件下则遭到降解）以外,对噬菌体　ＨＡＵ３的抗性也随之消失,这项特征主要表现在噬菌斑大小和成斑单位（效价）上的显著变化。研究结果表明,噬菌体　ＨＡＵ３以同等的频率吸附野生型变铅青链霉菌及其突变菌株ＺＸ１,从　ＨＡＵ３基因组中没有克隆到被变铅青链霉菌识别的特异性靶位点;噬菌体ＨＡＵ３的ＤＮＡ也可以转染野生型变铅青链霉菌原生质,但其释放的噬菌体粒子只能感染突变菌株ＺＸ１,而不能感染野生型变铅青链霉菌。噬菌体ＨＡＵ３在突变株ＺＸ１中的繁殖遵循一步生长曲线,单菌释放量大约为１００,而　ＨＡＵ３感染野生型变铅青链霉菌后,则检测不到噬菌体的释放。     

大肠杆菌甲基转移酶dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响

【目的】大肠杆菌的dcm基因编码的DNA甲基转移酶可以特异性地将5′CCWGG3′(W=A/T)序列中第二个胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶。Dcm甲基转移酶发现已有37年了,但其确切的功能不明,本篇主要研究其对变铅青链霉菌的影响。【方法】通过构建克隆、接合转移、异源表达及HPLC、酶切、Southern杂交等方法研究dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响。【结果】首次发现变铅青链霉菌基因组中不含5-甲基胞嘧啶修饰,将dcm基因导入变铅青链霉菌后,接合子菌落比正常菌落小很多,并有放线紫红素产生。【结论】基因组的表观遗传修饰能激活沉默放线紫红素基因簇的表达这一现象,为基因组挖掘隐藏的活性天然产物提供了一条新途径。     

抗生素和干扰素

924355能产生曲张链菌素复合物的链霉菌种〔英万Vesse-linova,N.…了Folia Mierobiol一1901,56 (6)。一535~541〔译自DBA,1992,11犷11),92一06133〕 研究了链霉菌菌株1000的形态学、培养和生理生化特性及其抗生素的产生。在菌丝体和培养滤液中均产生抗生素一1011和一1012,4天后抗生素的生物合成达最大值(4 109/1)。菌株1。。o的变种1011能产生10oomg/1抗生素一1021,将之与亲本菌株10。。的生产水平(41mg/l)进行比较。经鉴定抗生素一1011为曲张链菌素。在相同培养条件下,2株链霉菌的产物组分有不同。菌株100。和壮观链霉菌(5.。户ec‘ab￡…     

5-甲基胞嘧啶修饰对沉默抗生素基因的激活

对真核生物的表观遗传学研究表明,5-甲基胞嘧啶修饰参与了多种重要生理功能。虽然在原核生物中也存在5-甲基胞嘧啶修饰,但其具体功能尚未确定。大肠杆菌编码的Dcm甲基转移酶负责DNA的5-甲基胞嘧啶修饰[1],有研究报道显示,Dcm与细菌的限制修饰系统相关[2];也有研究报道dcm基因能影响大肠杆菌中核糖体基因的表达,从而影响初级代谢和次级代谢[3]。本期介绍了高婕、贺新义等发表的论文"大肠杆菌甲基转移酶dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响"[4],作者巧妙地利用变铅青链霉菌的DNA无甲基化修饰这一特点,将大肠杆菌dcm基因导入变铅青链霉菌,研究了5-甲基胞嘧啶修饰在变铅青链霉菌中的功能。结果发现,DNA的5-甲基胞嘧啶修饰不仅可影响变铅青链霉菌的形态和生理分化,而且还能激活放线紫红素沉默基因的表达。论文作者以变铅青链霉菌为材料,拓展了对原核生物DNA5-甲基胞嘧啶修饰的生理功能的认识。以此为基础的深入研究,不仅有助于揭示5-甲基胞嘧啶修饰在原核生物中的功能,而且有可能为沉默抗生素基因的表达或抗生素产量的提高提供一个新的途径。     

抗生素和干扰素

920494氮素同化作用对调节抗生素生产的影响〔俄〕/Chi-peva,V.…产Antibiot.Khimioter一1991,36(3)一5~s〔译自DBA,1992,20(22),91-06742〕 研究了在发酵吸水链霉菌(尽加。川。。,。e。甸卯os““州“哪)生产抗生素期间,氮素同化作用途径中酶的活力,这些酶包括谷氨酸脱氢酶(GD-H)、谷氨酞胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(G-OGAT)和丙氨酸脱氢酶(ADH)。将吸水链霉菌155置于含各种N源的培养基(2 09/1葡萄糖、3 .59/IKH:PO‘、0.69/IMgSO‘·了H:O和zml微量元素溶液)中,于28℃、240印m搅拌下培养。没有观察到GDH活性,高浓度的钱和丙氨…     

人肿瘤坏死因子β(hTNFβ)在变铅青链霉菌中的表达研究

以变铅青链霉菌为宿主研究了人INFβ(hTNFβ)的异源表达。应用链霉菌S.VENEZUELAC cbs762.70分泌产生的枯草杆菌蛋白酶抑制剂vsi基因的启动子、表达调控序列和分泌信号肽序列,分别对hTNFβ进行了直接分泌表达、分泌融合表达和胞内表达。将hTNFβ的cDNA分别直接融合于vsi信号肽序列下游2个氨基酸处、vsi全长基因之后以及vsi起始密码子ATG的下游,获得的表达盒分别克隆至链霉菌高拷贝质粒pIJ486,转化Streptomyces lividans TK24,获得了重组菌株S.lividans(pIJ486-hTNFβ),s.LIVIDANS(PIJ486-vsi-hTNFβ)和S.lividans(pIVPA-hTNFβ)。分别对不同的重组菌株进行摇瓶培养,对其培养的上清液和细胞裂解液进行SDS—PAGE和Westen杂交,结果表明：hTNFβ在重组菌株中均获得了表达,且直接分泌产物和胞内表达产物均具有生物学活性。hTNFβ直接分泌表达产物的分子量约为16kDa,NB培养基中培养48h时表达水平约为0．7mg／L。胞内表达产物分子量与对照重组hTNFβ一致(18．7kDa),但随培养时间的延长远步降解为16kDa,NB培养基中培养48h时的表达水平(25．1mg／L)远高于其直接分泌表达水平。     

负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针,通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物,扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77%~100%。其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA序列100%一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素,中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中重新引入野生型nsdA,又失去产抗生素能力。表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达;nsdA的广泛存在及其序列高度保守则提示可以尝试用于这些菌种的抗生素高产育种。     

天蓝色链霉菌孢子形成的关键基因——whiG的诱导表达

与链霉菌分化有关的whiG结构基因已亚克隆到链霉菌表达载体pAK203的tipA启动子下游.该启动子能被硫链丝菌素诱导.whiG基因的诱导表达不仅可使天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71恢复产生孢子的能力,而且也能使天蓝色链霉菌野生型菌株J1501和变铅青链霉菌TK54的孢子形成更为丰满.Western杂交也进一步证实了诱导表达后whiG基因产物——σ~(whiG)产量的增加.这为依赖于σ~(whiG)RNA多聚酶的发育调控启动子体外转录的研究提供了有利条件.     

医药上的应用

抗生素和干扰素931958在始旋链,菌中诱导产生原始.案〔英万Paquet,V.…/Bioteehnol.Lett一1992,14(11)。-1065~1070〔译自DBA,1903,12(i),。3-00090] 利用若干内酩检测了始旋链霉菌非生产突变株 (C16/4)和高产突几变株(Prn)中原始霉素 (PM)生产的调节作用。将Prn置于含复合培养基(pHe.s)的21发酵罐内,于27℃、450~1000rpm搅拌和41/min通气条件下培养。再于含合成培养基的201发酵罐内搅拌(5。。印m)培养Prll (pH6.s、27℃、通气51/min),以生产诱导因子。温育48小时后PM产生达最大。具长侧链的内醋(0 .25产g/ml诱导浓度)均对PM生产有…     

单点突变葡萄糖异构酶(GIG138P)基因在变铅青链霉菌中的高效表达及其稳定性研究

通过三步亚克隆 ,将单点突变葡萄糖异构酶 ( GIG1 38P)基因及其调控序列插入链霉菌质粒p IJ40 83,构建重组表达质粒 p IJ40 83- GI1 .用重组质粒转化变铅青链霉菌 TK54原生质体 ,经硫链丝菌素抗性 ( Th R)筛选 ,获得重组菌株 TK54/p IJ40 83- GI1 .酶活力测定和 SDS- PAGE分析表明 ,GIG1 38P基因在变铅青链霉菌中得到高效表达 ,GI1粗酶液比活力为 1 5U/mg,GI1表达量约占菌体可溶性蛋白的 2 5% .同时也研究了重组质粒的遗传稳定性 .重组菌株在无选择压力条件下经液体连续传代培养 ,GI1比活力和 GI1表达量在 2 0 0 h传代时间中呈平缓下降趋势     

灰色链霉菌胰蛋白酶在变铅青链霉菌中的异源表达及酶学性质分析

胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域.本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较.以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得胰蛋白酶编码基因sprT并克隆至表达质粒pIJ86,成功构建了重组链霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT.以R2YE和SELF为发酵培养基,最高酶活分别达9.21 U/mL和8.61 U/mL.酶学性质分析表明,和牛胰蛋白酶(BT)相比,重组链霉菌胰蛋白酶(rSGT)的耐酸能力强,具有较广的pH;且rSGT对酰胺键具有更高的特异性;此外,Zn2+和有机溶剂分别对rSGT的酯酶活力和酰胺酶活力具有促进作用;本研究结果为rSGT的性质改造以及工业应用提供了依据.     

变铅青链霉菌TK24 secE启动子表达特性的研究

通过PCR扩增得到变铅青链霉菌（Streptomyces lividans)TK24 secE基因上游496bp的片段,其序列与S.coelicolor secE启动子序列同源性为99.8%。将该序列克隆到以儿茶酚加氧酶基因（xylE)为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,并转化S.lividans TK24原生质体,获得了重组菌株S.lividans [pIJ4083-secE]。S.lividans[pIJ4083-secE]菌株发酵结果表明,secE启动子为强启动子,活性与vsi基因启动子相当。secE启动子的表达在对数生长期达到高峰,平台期下降;28℃发酵培养时secE启动子活性远高于37℃发酵培养;比较了不同发酵培养基Phage,NB和CM中secE启动子的活性;实验结果还表明培养基中葡萄糖含量对secE启动子的表达有抑制作用。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究

应用两种链霉菌新型信号肽--vsi和gpp在常用工程菌变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）中进行了CTLA-4的分泌表达研究,vsi信号肽与CTLA-4的融合片段克隆至链霉素-大肠杆菌穿梭质粒pUWL-219,同时gpp信号肽与CTLA-4片段在质粒pLNSP中融合,分别转化S.lividans TK24,获得重组菌株S.lividans[pUWL219-VC]和S.lividans[pLNSP/CTLA-4]。重组菌株的发酵上清液经SDS-PAGE及Western blotting分析结果表明：应用不同信号肽构建的两株工程菌均能表达分子量为13000重组蛋白,具有免疫活性。     

应用响应面法优化发酵培养基提高达托霉素产量

【背景】达托霉素来自玫瑰孢链霉菌NRRL 11379的发酵产物,是重要的临床用抗生素。其原始产生菌发酵周期长,影响达托霉素的生产效率。本实验室前期在天蓝色链霉菌中重构了达托霉素的生物合成途径,有效地缩短了发酵周期,但重组菌株K10中达托霉素发酵产量很低,制约了后续的研究和开发。【目的】利用响应面法优化产达托霉素的重组菌天蓝色链霉菌K10的发酵培养基组分,获得达托霉素高产的发酵培养基配方。【方法】采用单因素实验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面法设计优化达托霉素发酵培养基,使用Design Expert 8.0对实验数据进行分析。【结果】培养基各成分中影响达托霉素产量的3个主要因素是糊精、酵母提取物和酪蛋白,其最佳浓度分别为25.11、2.20和2.00 g/L。在此条件下,达托霉素产量达到15.30 mg/L,较原始培养基产量提高了2.17倍。【结论】实验获得了达托霉素产量明显提高的天蓝色链霉菌K10发酵培养基配方,为达托霉素的后续研究提供可靠支撑。