过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

[目的]进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度.[方法]将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T. glabrata CCTCC M202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U/mg蛋白的重组菌T. glabrata-PDnoxE.[结果]与出发菌株T. glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36 h葡萄糖消耗完毕.补加50 g/L葡萄糖继续发酵20 h,则使丙酮酸浓度提高到67.2 g/L.葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%.而NAD<' 增加了11.1%.[结论]增加细胞内NAD<' 含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度.     

营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体,广泛应用于化工、制药及农用化学品工业。能够直接发酵生产丙酮酸的菌种主要有Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ[1],Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ[2],Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ[3],Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ[4],Ａｇａｒｉｃｕ?..     

添加TCA循环中间产物加速光滑球拟酵母积累丙酮酸

在维生素限制的条件下,研究了添加TCA循环中间产物对光滑球拟酵母多重维生素营养缺陷型菌株CCTCC M202019生长和积累丙酮酸的影响。该菌株能以TCA循环中间产物为唯一碳源进行生长,且在以葡萄糖、乙酸和TCA循环中间产物为复合碳源的平板上菌落数高于分别以葡萄糖和乙酸或TCA循环中间产物为唯一碳源时的菌落数。与其它TCA循环中间产物相比,草酰乙酸更能促进细胞的生长、提高丙酮酸产量和对葡萄糖的得率。草酰乙酸能够促进细胞生长,是因为T. glabrata CCTCC M202019菌株能够利用乙酸作为乙酰辅酶A供体。在含有100 g/L葡萄糖和6 g/L乙酸钠的培养基中再添加10 g/L草酰乙酸进行分批发酵实验,可使菌体浓度从11.8 g/L提高到 13.6 g/L,增长幅度为15%;丙酮酸对葡萄糖的得率(0.66 g/g)以及生产强度(1.19 g·L^{-1<、sup>·h-1<、sup>)分别高出6%和24%,使发酵结束时间提前8～12h。}     

降低光滑球拟酵母电子传递链活性加速丙酮酸合成

光滑球拟酵母CCTCCM2 0 2 0 19经溴化乙锭诱变 ,挑选假阳性呼吸缺陷型菌株共 4 0株。对其中 7株丙酮酸产量提高的突变株进行发酵性底物 (葡萄糖 )和非发酵性底物 (甘油、乙酸 )的利用能力测试 ,鉴定得到 3株呼吸缺陷型突变株RD 16、RD 17和RD 18。相对于出发菌株 ,呼吸缺陷型突变株生长速率下降 ,最终菌体浓度降低 2 1%～2 9% ,胞内ATP含量下降 15 %～ 2 1% ,但单位细胞耗葡萄糖能力和单位细胞产丙酮酸能力分别提高了 2 0 7%～30 7%和 30 7%～ 5 5 5 %。进一步研究发现 ,呼吸缺陷型突变株线粒体复合体Ⅰ、Ⅰ Ⅲ、Ⅱ Ⅲ和Ⅳ的活性分别下降了 34%～ 4 1%、38 6 %～ 5 2 6 %、2 1%～ 2 5 %、15 0 %～ 6 30 % ,表明线粒体电子传递链氧化NADH的功能受到抑制。为使酵解产生的NADH正常氧化 ,在RD 18菌株的对数生长期流加 2 1mmol L外源电子受体乙醛。发现细胞合成丙酮酸能力提高 2 1 6 % ,且葡萄糖消耗速度明显加快 ,发酵周期缩短 14h。结果表明适当削弱能量代谢能够提高真核微生物中心代谢途径的速度     

光滑球拟酵母生理功能解析与调控

多重维生素营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata),是工业发酵生产丙酮酸最具竞争力的菌株.由于其独特的基因组特征和优越的生产表型,通过营养、环境条件和辅因子水平能有效地调控T.glabrata的生理功能,进而将代谢流最大化、快速化的导向目标产物.本文总结了T.glabrata在基因组测序、生理功能解析与调控等方面所取得的研究进展,并评估了利用T.glabrata生产精细化学品的潜力.     

异源表达NADH选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及丙酮酸生产强度

摘要：【目的】为进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)葡萄糖代谢速率及丙酮酸生产强度。【方法】将源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的编码选择性氧化酶的AOX1基因过量表达于T. glabrata中,获得了一株线粒体内NADH氧化途径发生改变且胞内总NADH 氧化酶活性提高1.8倍的重组菌株AOX。【结果】与出发菌株CON比较,细胞浓度以及发酵周期降低了20.3%和10.7%,而平均比葡萄糖消耗速率和丙酮酸合成速率分别提高了34.7%和54.1%。其原因     

氧化磷酸化抑制剂对光滑球拟酵母糖酵解速度的影响

研究了不同浓度电子传递链抑制剂 ( 鱼藤酮和抗霉素 A) 和 F_OF₁-ATPase 抑制剂 ( 寡霉素 ) 对光滑球拟酵母胞内 ATP 水平、葡萄糖消耗速度、糖酵解途径关键酶的影响 . 在培养液中添加 10 mg/L 鱼藤酮和抗霉素 A ,相对于对照组,胞内 ATP 分别下降了 43% 和 27.7% ,使糖酵解关键酶磷酸果糖激酶 (PFK) 的活性分别提高 340% 和 230% ,从而导致葡萄糖消耗速度增加 360% 和 240% ,丙酮酸生成速度提高了 17% 和 8.5%. 改变胞内 ATP 水平并不影响糖酵解途径其他关键酶 HK 、 PK 活性 . 微量的寡霉素 (0.05 mg/L) 可使胞内 ATP 含量下降 64.3% ,当培养液中寡霉素浓度达到 0.4 mg/L 时,细胞不能继续生长,葡萄糖消耗速度和丙酮酸的生成速度却随着寡霉素浓度 ( 小于 0.6 mg/L) 的增加而增加 . 表明氧化磷酸化途径中, ATPase 决定着 ATP 的生成 . 降低胞内 ATP 含量能显著提高 PFK 活性 (r²=0.9971) ,葡萄糖消耗速度 (r²= 0.9967) 以及丙酮酸生产速度 (r²= 0.965) ,葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶 PFK 活性 (r² = 0.9958) 和 PK 活性 (r²= 0.8706) 增加所导致的 . 这一结果有利于揭示真核微生物细胞中氧化磷酸化与中心代谢途径 ( 酵解 ) 的关系 .     

营养条件对光滑球拟酵母积累α-酮戊二酸的影响

以光滑拟球酵母为研究模型,研究α-酮戊二酸的浓度情况。通过单因素实验得到α-酮戊二酸积累最佳浓度的各单因素条件为：葡萄糖浓度140g／L,NH4Cl浓度5g／L。在碳源（30g/L葡萄糖初始浓度）匮乏条件下加入丙酮酸30g／L,在此条件下丙酮酸转化为α－酮戊二酸的转化率最高达53．7％。以30g／L丙酮酸为唯一碳源时在7L发酵罐中光滑拟球酵母可生成浓度为10．7g/Lα-酮戊二酸,外源丙酮酸的转化率可达66．9％。这一结果表明,T．glabrata具有将丙酮酸转化为α-KG的能力。     

光滑球拟酵母中AMP代谢对其生理功能的影响北大核心CSCD

【目的】研究光滑球拟酵母(Candida glabrata)中AMP代谢影响其碳流代谢和耐酸胁迫的生理机制。【方法】同源重组法敲除基因cgade12(ORF CAGL0K05027g)和cgade13(ORF CAGL0B02794g)构建双缺菌株cgade12Δade13Δ,与出发菌株(ATCC55)比较ATP水平、碳流代谢酶活性和中间代谢物含量变化分析和AMP代谢对其碳流代谢的影响,对比菌株有机酸胁迫下生长情况及胞内环境变化,研究AMP代谢变化对光滑球拟酵母酸胁迫耐受性的影响。【结果】与出发菌株ATCC55相比,cgade12Δade13Δ的ATP水平下降了12.50%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ中柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶的活性分别上升了31.26%、19.45%、28.96%、18.36%,柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸含量分别提高了44.11%、73.60%、50.00%、65.68%。胞内丙酮酸浓度下降20.00%,丙酮酸产量下降73.11%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ在0.4%丙酮酸、0.6%苹果酸和0.2%乙酸胁迫下的菌体浓度分别提高了8.71%、11.21%和12.71%。在0.2%乙酸胁迫下,菌株cgade12Δade13Δ的H^+-ATPase活性、细胞膜完整度、细胞膜电势分别比出发菌株ATCC55上升了7.04%、8.71%、25.14%,ROS水平下降了19.51%。【结论】基因cgade12、cgade13的缺失导致菌株的ATP水平下降,TCA循环活性和有机酸耐受性上升。     

光滑球拟酵母生产2,3-丁二酮的系统代谢工程策略

【目的】调控丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019碳代谢流分布促进2,3-丁二酮积累。【方法】过量表达来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合成酶(ALS);在此基础上,借助T.glabrata全基因组规模代谢网络模型(GSMM)iNX804解析敲除基因ILV5的必要性;敲除基因BDH以阻断2,3-丁二酮的降解。【结果】过量表达ALS将ALS活性提高了4.6倍,发酵液中2,3-丁二酮浓度从0.01 g/L提高至0.57 g/L。敲除基因ILV5使2,3-丁二酮浓度提高28.1%。敲除基因BDH导致丁二酮还原酶和丁二醇脱氢酶活性分别降低74.4%、76.1%,同时2,3-丁二酮进一步代谢产物3-羟基丁酮和2,3-丁二醇浓度则分别降低52.2%和71.4%,2,3-丁二酮浓度为0.95 g/L。【结论】基于GSMM的系统代谢工程策略能够将碳代谢流从丙酮酸节点导向2,3-丁二酮,实现2,3-丁二酮的有效积累。     

Enhancement of pyruvate production by osmotic-tolerant mutant of Torulopsis glabrata

Pyruvate production by Torulopsis glabrata was used as a model to study the mechanism of product inhibition and the strategy for enhancing pyruvate production. It was found that the concentration of cell growth and pyruvate deceased with the increase of NaCl and sorbitol concentrations. To enhance the osmotic stress resistance of the strain, an NaCl-tolerant mutant RS23 was screened and selected through a pH-controlled continuous culture with 70 g/L NaCl as the selective criterion. Compared with the parent strain, mutant RS23 could grow well on the medium containing 70 g/L NaCl or 0.6 mol/L sorbitol. Pyruvate concentration by the mutant strain RS23 reached 94.3 g/L at 82 h (yield on glucose 0.635 g/g) in a 7-l fermentor with 150 g/L glucose as carbon source. Pyruvate concentration and yield of mutant RS23 were 41.1% and 11.1% higher than those of the parent strain, respectively. The strategy for enhancing pyruvate production by increasing osmotic stress resistance may provide an alternative approach to enhance organic acids production with yeast.     

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进a-酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303 的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,a-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累a-酮戊二酸。     

Manipulating the pyruvate dehydrogenase bypass of a multi-vitamin auxotrophic yeast Torulopsis glabrata enhanced pyruvate production

AIMS: To investigate the relationship between the activity of pyruvate dehydrogenase (PDH) bypass and the production of pyruvate of a multi-vitamin auxotrophic yeast Torulopsis glabrata. METHODS AND RESULTS: Torulopsis glabrata CCTCC M202019, a multi-vitamin auxotrophic yeast that requires acetate for complete growth on glucose minimum medium, was selected after nitrosoguanidine mutagenesis of the parent strain T. glabrata WSH-IP303 screened in previous study [Li et al. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 680-685]. Strain CCTCC M202019 produced 21% higher pyruvate than the parent strain and was genetically stable in flask cultures. The activities of the pyruvate metabolism-related enzymes in parent and mutant strains were measured. Compared with the parent strain, the activity of pyruvate decarboxylase (PDC) of the mutant strain CCTCC M202019 decreased by roughly 40%, while the activity of acetyl-CoA synthetase (ACS) of the mutant increased by 103.5 or 57.4%, respectively, in the presence or absence of acetate. Pyruvate production by the mutant strain CCTCC M202019 reached 68.7 g l(-1) at 62 h (yield on glucose of 0.651 g g(-1)) in a 7-l jar fermentor. CONCLUSIONS: The increased pyruvate yield in T. glabrata CCTCC M202019 was due to a balanced manipulation of the PDH bypass, where the shortage of cytoplasmic acetyl-CoA caused by the decreased activity of PDC was properly compensated by the increased activity of ACS. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Manipulating the PDH bypass may provide an alternative approach to enhance the production of glycolysis-related metabolites.     

乙酸渗漏型丙酮酸高产菌的选育

对Torulopsis glabrata WSH-IP303进行NTG诱变,挑选以乙酸为补充碳源的平板上透明圈较大的菌落,经初筛和复筛,发现T.glabrataWSH-LQ307生产丙酮酸能力强且稳定。以乙酸为补充碳源摇瓶培养48h,其丙酮酸产量（46.2g/L)比出发菌株（38.3g/L)提高21%,采用该菌株在5L发酵罐上进行4批发酵实验,丙酮酸产量在64h最高可达68.7g/L,对葡萄糖的转化率为0.651g/g。     

一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平 ,在途径分析的基础上提出了一种组成型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略。通过亚硝基胍诱变 ,获得 1株乙酸需求型突变株CCTCCM2 0 2 0 19,在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株 2 1%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCCM2 0 2 0 19中丙酮酸代谢相关酶的活性发现 :(1)丙酮酸脱羧酶活性降低了 4 0 % ;(2 )外加乙酸与否的条件下 ,乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了 10 3 5 %和 5 7 4 % ;(3)添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。在含有乙酸的培养基中突变株细胞干重比出发株高 2 1 7% ,可能是因为乙酰辅酶A合成酶活性的提高 ,补充了因丙酮酸脱羧酶活性降低而引起的胞质乙酰辅酶A短缺。在 7L罐中含有 6g L乙酸钠的培养基中发酵 6 2h ,丙酮酸产量达到 6 8 7g L ,对葡萄糖的产率为 0 6 5 1g g。     

光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的生产强度,在能量代谢分析的基础上提出了降低ATP合成酶活性、但不影响NADH氧化的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得一株新霉素抗性突变株N07,该菌株F1ATPase活性降低65%、丙酮酸产量高于48gL且单位细胞消耗葡萄糖能力提高38%。添加双环己基碳二亚胺(DCCD)、叠氮钠(NaN3)、新霉素显著降低出发株F1ATPase活性但不影响突变株F1ATPase活性。突变菌株胞内ATP含量下降23.7%导致生长速率和最终菌体浓度(为出发菌株的76%)均低于出发菌株,但葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高34%和42.9%,发酵周期缩短12h。进一步研究发现,突变株糖酵解途径中关键酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油醛激酶的活性提高了63.7%、28.8%和14.4%,电子传递链关键酶活性提高10%。结果表明降低真核微生物F1ATPase活性有效地提高了糖酵解关键酶活性而加速葡萄糖代谢。     

Significant increase of glycolytic flux in Torulopsis glabrata by inhibition of oxidative phosphorylation

This study was aimed at increasing the glycolytic flux of the multivitamin-auxotrophic yeast Torulopsis glabrata by disturbing oxidative phosphorylation. We examined two different strategies to impede oxidative phosphorylation. The first strategy was disruption of the activity of the electron transfer chain (ETC), by either of two approaches. One was separately adding, at 10 mg L1, specific inhibitors of complex I (rotenone) or of the bc1 complex (antimycin A) to the culture broth of T. glabrata CCTCC M202019, which resulted in significantly decreased intracellular ATP levels (43% and 27.7%) and significantly increased rates of glucose consumption (qs) and pyruvate production (qp); another approach was breeding a respiratory-deficient mutant RD-16, in which cytochromes aa3 and b in the ETC were deleted after ethidium bromide mutagenesis, to reduce the ETC activity constitutively. The second strategy was inhibiting F0F1-ATP synthase with 0.05 mM oligomycin. Also, a neomycin-resistant mutant with 65% decreased F0F1-ATPase activity was studied. With the two strategies, the specific activity of phosphofructokinase (R2=0.9971), the average specific glucose consumption rate (R2=0.9967) and the average specific pyruvate production rate (R2=0.965) were closely correlated with the intracellular ATP level, all of them being increased at a lower intracellular ATP level.