壳寡糖诱导植物抗性相关基因mRNA差别显示分析

壳寡糖是一种天然的信号分子,可以诱导植物产生各种防御反应。该文利用mRNA显示技术。研究壳寡糖引起的植物抗性相关基因的变化。以50mg/l壳寡糖喷洒的烟草叶片为材料,分别提取处理8h、7d和对照的叶片总RNA,利用一个锚定引物和三个随机引物组合,通过mRNA差别显示技术共获得壳寡糖处理后发生变化的8h差别条带22条,7d后的差别条带为74条。将壳寡糖处理8h得到的17条差别条带克隆到载体上后,进行反向Northern鉴定,有6条可能为真实条带。测序结果表明：其中一条差别片段与烟草热激蛋白90基因具有97％的核苷酸同源性。说明50mg/l壳寡糖处理的烟草叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,烟草的热激蛋白90基因可能参与到壳寡糖诱导的抗性信号传导通路中。     

真菌源激发子对采后葡萄果皮抗性产生的诱导

利用细胞壁提取法从葡萄采后致病菌Alternaria alternate(Fr．)Keissl中提取出激发子。在采前一周用激发子处理葡萄,研究激发子诱导葡萄采后抗病效果。结果表明：葡萄经激发子处理后,果皮内与抗病有关的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著增强,酚类物质和木质素含量也显著提高,贮藏期自然发病率和发病指数降低,其中以125μg·mL-1处理效果最好,果实发病率和发病指数比对照降低500％左右。     

壳寡糖诱导植物防御反应中一氧化氮信号的研究

壳寡糖可以增强植物对病虫害的防御能力,为了深入研究壳寡糖的作用机理,首次运用荧光酶标仪及一氧化氮(Nitric oxide,NO)荧光探针Diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA)对壳寡糖诱导的NO信号进行研究。研究发现,不同浓度的壳寡糖均可诱导烟草悬浮细胞产生NO;NO的清除剂Carboxy-PTIO potassium salt(cPTIO)和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)抑制剂N^ω-nitro-L-arginine methyl Ester(L-NAME)可以明显抑制NO的产生;硝酸还原酶(Nitrate reductase, NR)的抑制剂叠氮化钠和钨酸钠对NO的产生无影响;Ca²⁺流相关抑制剂氯化镧和钌红均可抑制NO的产生。NO和Ca²⁺流的相关抑制剂可明显抑制壳寡糖诱导的抗性相关基因的表达。结果显示:壳寡糖主要通过NOS酶催化合成NO,且NO参与调节壳寡糖诱导的抗性相关基因的表达,在此过程中,Ca²⁺可以调节NO的合成。     

壳寡糖诱导水稻过敏性细胞死亡及抗病性的提高

作为真菌细胞壁的主要成分之一的壳寡糖(Oligo-GlcNAc)能够诱导水稻悬浮细胞和幼叶细胞发生过敏性死亡,并伴有H2O2的积累.以1 μg*mL-1壳寡糖处理水稻悬浮细胞12 h后细胞明显死亡;诱导水稻幼叶细胞出现明显的死亡所需壳寡糖浓度为5 μg*mL-1.以壳寡糖处理的水稻抗稻瘟病性也明显增强.     

壳寡糖诱导烟草对TMV长距离移动的影响

采用ELISA-DSM法和半叶枯斑法,测定了壳寡糖(50μg/mL)诱导后普通烟(Nicotiana tabacum)植株体内TMV浓度的变化.ELISA-DSM测定显示,在接种后10 d,仅在接种叶的上位叶和新生叶片中检测到病毒,且病毒浓度仅为不诱导对照的52.7%和38.8%,在下位叶中未检测到病毒;同时,接种叶内病毒增殖严重受抑,接种后10 d,病毒浓度仅为不诱导对照的23.52%.半叶枯斑法检测获得了相同结果,以壳寡糖处理植株的不同叶位的叶片为毒源,产生的枯斑数目都大幅度低于不诱导对照.以上结果证明,壳寡糖处理后TMV的上行和下行长距离移动均明显延迟和减少,下行移动受到的影响更大.透射电镜检查发现,处理植株接种叶的下位叶片韧皮部细胞中没有病毒晶体和病毒粒子,在上位叶片筛管伴胞中仅见少量病毒粒子,两者都未发现任何诱导新生物,也未见其他细胞结构变化.结果表明,壳寡糖处理使烟草对TMV病毒侵染产生了诱导抗病性,系统侵染症状明显减弱;壳寡糖处理对病毒长距离移动的不利影响可能是接种叶片病毒增殖减少所造成的.     

壳寡糖诱导的烟草SKP1基因表达

壳寡糖是一种高效的植物抗性诱导剂,应用mRNA差异显示技术从经过壳寡糖诱导的枯斑三生烟草叶片中分离到了编号为5、31、37和46的4个基因片段.4个基因片段与本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)SKP1基因的mRNA同源性都达到82%,据此推断这4个片段是感病烟草品种枯斑三生烟草的SKP1基因.质粒双酶切及反向Northern分析结果表明,该基因表达在壳寡糖诱导下增强.由于SKP1基因与植物的抗病毒病相关,从而在mRNA水平上验证了壳寡糖的诱导抗性效应.     

壳寡糖对烟草花叶病毒的体外钝化作用

壳寡糖是一种由脱乙酰基几丁质经酶降解后制备的氨基葡萄糖,它具有多方面的生物活性,在调节植物的生理机能、调控植物形态发生、诱导植物抗病性、抗逆性以及抑制真菌、细菌的生长发育等方面的作用多有报道,但关于壳寡糖对植物病毒的抑制作用未见报道.     

壳聚糖酶的克隆表达与壳寡糖的制备分析

目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。     

小鼠肠道对壳寡糖的吸收率及吸收成分的影响

目的通过分析壳寡糖在小鼠肠道内的吸收率以及吸收成分,了解肠道对壳寡糖代谢的影响,初步判断壳寡糖的有效生物成分,为壳寡糖生物活性的进一步研究提供必要的实验材料和线索。方法首先用蜗牛酶将壳聚糖水解成聚合度不同的壳寡糖,并通过聚丙烯酰胺凝胶层析柱（Bio-Gel P4凝胶）将不同聚合度的壳寡糖分开,分别收集聚合度为1-3,8-11的壳寡糖,并用异硫氰酸荧光素（FITC）标记,再通过聚丙烯酰胺凝胶层析柱（Bio-Gel P-2/P4）将游离的FITC除去,随后对两组禁食24 h的小鼠分别用FITC标记的大分子量和小分子量的壳寡糖灌胃。1 h后取血清和小肠,经分离水溶成分后,通过荧光分光光度计检测血清样品和肠溶物样品中荧光的强度,进而确定壳寡糖的吸收率和吸收成分。结果通过改变酶解时间,蜗牛酶可以将壳聚糖水解成不同聚合度的壳寡糖。利用Bio-Gel PA聚丙烯酰胺凝胶层析柱可以将不同聚合度的壳寡糖分离成具有一定聚合度范围的壳寡糖。用F1TC标记的大、小分子量的壳寡糖给小鼠灌胃,从血清和肠溶物中均检测到荧光强度,两者比值平均值分别为5.68 ： 1和9.84 ： 1。结论壳寡糖在肠道的吸收率随分子量的减小而增大,除小分子壳寡糖外,吸收成分也包括部分大分子量壳寡糖。     

壳寡糖对乳酸杆菌体外生长的影响

目的:研究壳寡糖对乳酸杆菌体外生长的影响。方法:将乳酸杆菌MRS培养基中的葡萄糖替换为壳寡糖及向原培养基中加入适量的壳寡糖,通过测定OD值比较乳酸杆菌的生长状况。结果:以壳寡糖完全代替葡萄糖的培养基中乳酸杆菌的生长状况不如MRS培养基,而少量壳寡糖与葡萄糖协同的培养条件使乳酸杆菌的生长适应期明显减短,促进其生长。结论:乳酸杆菌对壳寡糖的利用不如对葡萄糖的利用,1g/l壳寡糖与葡萄糖协同作用时可明显缩短乳酸杆菌的生长适应期,促进细菌生长。     

SPINDLY在壳寡糖诱导拟南芥抗丁香假单胞菌中的功能

为了探讨拟南芥O-岩藻糖基转移酶(SPINDLY)在病原体相关分子模式诱导抗性中的作用,该研究以SPINDLY缺失拟南芥突变体spy-3为实验材料,从叶片表型、病情指数、病菌定殖量以及丁香假单胞菌(Pst DC3000)关键基因的表达水平等指标,系统考察了SPINDLY在壳寡糖诱导拟南芥抗Pst DC3000中的功能。结果显示:(1)spy-3突变体比野生型更易被Pst DC3000侵染。(2)与病菌侵染组相比,壳寡糖预处理明显缓解植株叶片黄化现象,显著降低Pst DC3000的定殖量。(3)壳寡糖预处理的spy-3植株中水杨酸和茉莉酸途径相关基因的表达量及水杨酸和茉莉酸含量均较病菌侵染组明显升高。(4)壳寡糖在spy-3中的诱抗效果与野生型相比无明显差别。研究表明,SPINDLY在植物先天免疫过程发挥重要作用,但并不影响壳寡糖的诱导抗性。     

壳寡糖的制备及其在医学和农业生产中的应用

壳寡糖为一种由2~10个氨基葡萄糖经β-1,4糖苷键连接而成的寡糖聚合物,可通过化学水解或酶降解几丁质或壳聚糖获得,在医学及农业生产等各个领域具有广泛的研究和应用价值。壳寡糖天然无毒,分子量相对较低,水溶性好,易于吸收,且具有良好的生物相容性。此外,壳寡糖也表现出了良好的生物学活性,包括抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗菌、改善糖脂代谢紊乱、保护神经损伤等。对壳寡糖的制备和表征、生物学功能及应用进展进行了综述,并对壳寡糖产业目前存在的问题及未来的研究方向进行了讨论,以期为壳寡糖的深度开发提供依据。     

松花菜种质资源评价及根肿病、黑斑病兼抗材料筛选

松花菜是目前我国花椰菜消费的主要类型。根肿病和黑斑病是直接影响松花菜产量及品质的重要病害。选育商品性好、高抗多抗品种是松花菜的主要育种目标之一。本研究首次建立了松花菜种质资源花球性状评价体系,从花球紧实度、球形、球面光滑度、球面颜色、球面蕾粒大小、二级侧枝长度、花梗颜色、球面长毛情况8个方面对66份松花菜自交系进行评价,并对不同性状赋值以便统计、比较。利用上述体系共筛选出11份花球性状优良的材料。采用苗期人工接种技术分别对松花菜根肿病和黑斑病抗性进行鉴定评价,结果显示无免疫根肿病材料,有2份高抗材料,9份抗病,16份中抗;无免疫和高抗黑斑病材料,有4份抗病材料,10份中抗。另外,兼抗两种病害的材料较少,其中GY-40对两种病害均表现抗病,GY-21对根肿病表现抗病,对黑斑病表现中抗,GY-39对两种病害均表现中抗。值得一提的是,GY-40性状优良且同时对根肿病和黑斑病具有较高抗性,是选育商品性好、抗病性强松花菜品种的理想亲本。本研究结果为评价松花菜种质资源花球相关性状提供了参考,对于规范资源的收集、整理和保存具有重要意义,同时为开展抗根肿病和黑斑病松花菜品种选育提供了优异材料。     

河北省冬枣黑斑病病原菌的分离鉴定及生物防治初探

冬枣黑斑病是冬枣重要病害之一,目前多以化学农药进行防治,给自然环境和人类健康带来了严重的威胁。河北省是冬枣种植大省,进行冬枣黑斑病病原菌的分离鉴定对冬枣黑斑病的有效防治具有重要意义。2014年8月至10月从河北省沧州、衡水、邯郸、邢台等地采集冬枣黑斑病病果,采用PDA培养基进行病原菌分离,从病样中共分离出2株分离频率较高的真菌,经过回接和再分离实验筛选出河北省冬枣黑斑病的致病菌株,经形态学和ITS序列分析初步确定该菌为细交链格孢(Alternaria alternata)。以枯草芽胞杆菌J18进行冬枣采后黑斑病的防治,浓度为1×108cfu/m L的菌液对病害的防效为80.67%。     

Induction of Volatile Organic Compounds of Lycopersicon esculentum Mill. and Its Resistance to Botrytis cinerea Pers. by Burdock Oligosaccharide

In the present study, we investigated the induction of volatile organic compounds （VOCs） of Lycoperslcon esculentum Mill. and its resistance to Botrytis cinerea Pers. by burdock oligosaccharlde. The disease severity of L. esculentum was evaluated 48 h after treatment with 0.6% burdock oligosaccharlde, followed by inoculation with a spore suspension of B. cinerea. The formation of O2＇, the activity of lipoxygenases （LOX）, peroxidase （POD）, cataiase （CAT）, and superoxide dismutase （SOD）, and the quantity and quallty of changes In VOCs were determined a period of time after treatment with 0.6% burdock ollgosaccharide. The results demonstrated that the disease index in treated plants was decreased by 42.5% compared with control 96 h after Inoculation. The production of O2＇ reached a maximum 6 h after treatment （1.36-fold compared with control）. There was an increase in LOX, POD, CAT and SOD activity in response to burdock oligosaccharide treatment and the enzymes showed different trends in the time-course of induction. At 120 h after treatment, （E）-2-hexenal was increased by 92% compared with control, whereas methyl salicylate showed a gradual Increase with induction period. Previous results had demonstrated that chitosan elicitor enhanced the production VOCs of L. esculentum and decreased plant susceptibility towards B. clnerea. Together, these findings suggest that increasing the production of VOCs in response to burrdock oligosaccharide may be an important mechanism for L. esculentumin its defense against pathogens, in addition, burrdock oligosaccharlde may act as a potent elicitor of resistance to disease in L. esculentum.     

Induction of Resistance in Melon to Didymella bryoniae and Sclerotinia sclerotiorum by Seed Treatments with Acibenzolar-S-methyl and Methyl Jasmonate but not with Salicylic Acid

The plant resistance activator acibenzolar‐S‐methyl (BTH), the signalling molecules salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) were tested by seed treatment for their ability to protect melon seedlings from gummy stem blight and white mould disease caused by the soil‐borne fungal pathogens Didymella bryoniae and Sclerotinia sclerotiorum, respectively. Didymella bryoniae infection on melon seedlings was completely suppressed by MeJA treatment. Necrotic lesions akin hypersensitive response occurred on all inoculated seedlings and prevented pathogen diffusion into healthy tissues. Didymella bryoniae infection was restricted following BTH seed treatment as well, although the percentage of necrotic lesions in comparison with the water soaked lesions was significantly lower than that from MeJA‐induced seedlings. BTH protected melon seedlings against S. sclerotiorum by the occurrence of a high percentage of necrotic lesions. A lower level of resistance was also achieved by MeJA seed treatment. The augmented level of resistance of tissues from BTH and MeJA‐treated seeds was associated with rapid increases in the activity of the pathogenesis‐related proteins chitinase and peroxidase. MeJA also determined a rapid and transient accumulation of lipoxygenase. Moreover, BTH and MeJA treatments determined the differential induction of particular de novo synthesized isoenzymes of these proteins. Results indicate that BTH and MeJA applied to melon seeds may activate on seedlings diverse metabolic pathways leading to the enhancement of resistance against distinct pathogens.     

First Report of Black Leaf Spot Caused by Alternaria alternata on Ramie in China

In 2012 and 2013, black leaf spot disease was observed on ramie plants in Hunan and Hubei Provinces, China. In the field, the symptoms of this disease included dark green to black big spots on leaves, often resulting in upwardly curled leaf margins. The pathogen isolates were identified as Alternaria alternata (Fr.) Keissler on the basis of morphology and sequence similarity of 99–100% to the published data for internal transcribed spacer (ITS), and glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase (gdp). To our knowledge, this is the first report of Alternaria leaf spot of ramie in China.     

烟草赤星病抗性主效QTL人工选择响应研究

分析赤星病抗性主效QTL的人工选择响应,可为烟草赤星病抗性分子标记辅助选择提供一定的理论基础。本研究利用与主效QTL紧密连锁的分子标记J9和J4,分析随机群体、人工选择群体和自然群体中响应分子标记的等位基因频率,研究相关标记位点在不同群体中的等位基因变化规律。结果发现:(1)赤星病抗性主效QTL等位基因在不同选择强度(5%、10%和20%)的正向选择条件下均发生了显著性偏分离,其中在10%的正向选择强度下偏分离显著性最高。(2)在不同世代(F3、F4、F5和F6)的赤星病抗性育种选择群体中,J9位点抗病亲本等位基因型频率显著高于感病亲本基因型频率,表明来源于抗源净叶黄的主效抗性QTL与赤星病抗性显著关联。(3)在198份自然群体中,包括烟草赤星病抗性品种中烟86、单育二号在内的50份烟草种质携带与抗源净叶黄相同的基因型,表明该主效QTL被广泛应用于烟草赤星病抗性改良中。本研究验证了之前定位到的主效抗病QTL的准确性;分析了该主效QTL的人工选择响应,相关结果为烟草赤星病抗性改良提供了一定的理论基础。     

一氧化氮在寡糖素诱导的小麦对条锈菌系统获得抗性中的时序性

研究了寡糖素在诱导感病小麦品种辉县红系统抗条锈性中的作用,同时利用ESR测定了系统获得抗性（SAR）中一氧化氮(NO)的时间进程,结果表明寡糖素可以诱导辉县红对条锈菌毒性小种CY29-1的系统抗性,此系统抗性与内源NO信号启动的时间及强度有关.