重组痘苗病毒在基因工程中的应用及展望

1982年以来,美国Moss及Panletti实验室相继报道了以痘苗病毒为载体,把单纯疱疹病毒TK基因、乙肝病毒表面抗原基因,流感病毒血凝素基因等重组至痘苗病毒基因组的特定部位,获得能表达外源基因的重组痘苗病毒。由于重组痘苗病毒具有一些特殊的特点和优点。     

痘苗病毒作为真核载体的研究现状及展望

1982年以来,美国Moss及Paoletti实验室相继报导了采用痘苗病毒作为载体,把单纯疱疹病毒TK基因、乙肝病毒表面抗原基因、流感病毒血凝素基因等重组至痘苗病毒基因组的特定位置上,得到能表达外源基因的重组痘苗病毒株。由于重组痘苗病毒具有一些特殊的特点,有希望发展成为一种新型的经济而有效的单价或多价疫苗,因而颇受学者们的重视。     

病毒来源的抗病毒基因的构建和在植物中的表达

寄主植物对病毒感染产生各种类型的抗病性,包括高度抗病的免疫性,抗侵染,抗扩展和抗增殖的抗病性,过敏性抗病性,耐病性以及对传毒介体的抗性。但是至今我们还不能把编码这些抗性的基因分离出来,进行基因转移。所以在植物基因工程中应用植植物来源的抗病毒基因为时尚早。由于病毒分了生物学的发展,已阐明了一些病毒的基因组的结构与功能,为利用病毒来源的抗病毒基因开辟了道路。随着DNA重组和克隆技术的发展,以及双子叶植物基因转化技术的日趋完善,使植物抗病毒的基因工程得以突破。已由病毒外壳蛋白基因、病毒卫星RNA的cDNA和病毒弱株系的全长cDNA转化植物,获得抗病性的表达。探索病毒来源的反意RNA和中和抗体基因作为抗病毒基因的可能性也在进行中。     

病毒的基因芯片分型技术及其应用

生物芯片技术是上世纪90年代发展起来的新型生物技术,它具有高通量、高度集成化、微型化、高敏感、高度平行性等特点。近年来,基因芯片技术已逐渐被应用于病毒的基因分型中。病毒的基因分型芯片是直接把病毒分型探针固定在基片上从而制成的基因芯片,本文主要对病毒的基因分型芯片技术及其应用进展进行综述。     

棉铃虫核型多角体病毒Ha105的序列分析及敲除和回复菌株的构建

通过生物信息学方法对Ha105的生物功能进行预测,运用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有350 bp同源臂的氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替换了棉铃虫病毒细菌人工染色体HaBacHZ8上的Ha105基因,然后利用Bac-to-Bac系统把Ha105回复到Ha105缺失的重组病毒上,构建了Ha105的缺失和回复重组病毒.生物信息学分析结果表明,Ha105是bro基因家族成员,含有Bro-N结构域,可能对宿主细胞的转录和病毒复制有一定影响.此外,重组病毒的PCR及酶切结果表明,成功构建了vHaHa105-KO-PH-gfp缺失菌株和vHaHa105-REP-PH-gfp、vHaHa105-REP-gfp回复菌株.该Ha105缺失及回复菌株的获得为进一步研究Ha105的功能奠定基础.     

病毒抗性大麦的开发

美国California大学Berkley分校Peggy Lemaux等与美国农业部(USDA)合作开发出导入了赋予大麦黄色矮化病毒抗性基因的重组大麦。它是用基因枪将黄色矮化病毒的编码蛋白基因射入切片的胚,再把这种基因导入大麦本身。 导入的编码基因是美国Washington州立大学和美国Purdue大学制作的。目前使用的是叫做Yd2的     

bm47基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制及转录的影响分析

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bm47基因普遍存在于已测序的鳞翅目核型多角体病毒基因组中,是杆状病毒的核心基因之一,但其在病毒复制及转录过程中的具体功能尚未可知。本研究利用Red重组技术在大肠杆菌BW25113中构建了BmNPV的bm47基因缺失型病毒bm47-ko-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了bm47基因的补回型病毒bm47-re-Bacmid。然后利用TCID50病毒滴度测定法和荧光定量PCR等方法研究了缺失bm47基因对病毒复制、转录及蛋白表达的影响。结果表明,bm47基因缺失后对病毒基因组的复制水平没有明显的影响;在病毒转染BmN细胞后48h和72h两个时相,bm47基因的缺失导致病毒早期基因lef3、晚期基因vp39以及极晚期基因p10的转录水平均有一定程度的下降。本研究工作将为深入研究BmNPV bm47在病毒复制和基因转录过程中的生物学功能奠定基础。     

双链RNA和植物对病毒的抗性

双链RNA能诱导转录后的基因沉默,是生物抵御病毒入侵、维持自身基因稳定的一种自我保护机制.把源自病毒的基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的高抗性.RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在风险,具有较高的生物安全性.双链RNA抗病毒转基因正在成为一种高效、安全的植物抗病毒策略.     

用Gateway 系统构建携带Grb2-SH2 基因重组慢病毒载体

目的:构建携带Grb2-SH2基因重组慢病毒载体。方法:把Grb2-SH2基因从合成的工程载体PUC-57中导到入门载体pentr-3C中,再利用LR反应重组到目的载体plenti,通过酶切和测序分析对比验证Grb2-SH2基因后,将plenti-Grb2-SH2质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞获得携带Grb2-SH2慢病毒载体。结果:构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确,目的基因片段大小约为500bp;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,转染效率约为90%。结论:成功构建转载质粒plenti-Grb2-SH2及携带Grb2-SH2基因慢病毒载体。     

痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的组建

我们从弱毒的痘苗病毒广-9株出发,构建了一个通用的痘苗病毒表达载体pGJP-5。广-9株的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因既作为表达载体与痘苗病毒基因组体内重组的同源顺序,又作为重组病毒的筛选标记。在TK结构基因中插入了编码痘苗病毒7.5K蛋白基因的启动基因(P_(7.5)),它可以有效地启动外源基因在痘苗病毒中表达。同时启动基因P_(7.5)的3′末端有BamHⅠ、SmaⅠ、SacⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点可供外源基因插入。     

基因转移技术中几种常见的病毒载体

在疾病的基因治疗过程中,需要用直接或间接的方法把目的基因导入细胞,使目的基因得到表达,或封闭、剪切致病基因的mRNA介导其特异性地降解,而达到治疗疾病的目的。介绍目前病毒载体基因转侈技术中最常用的载体如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体等。     

植物病毒互作研究及基因编辑技术在抗病育种中的应用进展

病毒病害是危害农作物生长的重要病害,最经济有效的防治策略是选育对病毒有抗性的品种。随着病毒与植物互作研究的深入,我们对于病毒在其生活周期中与其所依赖的植物基因的互作有了深入的认识。病毒进入植物细胞后,其病毒颗粒的解聚、基因的表达、基因组的复制、其核酸蛋白复合体通过包间连丝和韧皮部的移动等过程都依赖病毒基因与植物特定基因的相互作用。这些植物基因的隐性突变可以导致植物对病毒的抗性。这类变异存在于作物的自然变异群体中,可以直接应用于抗病育种。CRISPR/Cas介导的基因编辑技术是一种可以在动植物体内对DNA序列进行定点突变的新技术,在过去几年里得到了突飞猛进的发展。利用该技术对病毒所依赖的植物基因进行定点突变或编辑,从而打破病毒与植物基因的互作关系,为创造抗病毒的作物提供了一条行之有效的途径。植物病毒互作研究和基因编辑技术的结合可以克服自然变异群体中,病毒依赖基因隐性突变频率小的问题,加速相关种质资源的创新步伐。因此它们正成为两支有力的翅膀,推动抗病育种的腾飞。拟通过对基因编辑研究领域近两年的研究进展以及植物与病毒互作研究领域的研究成果进行归纳总结,为基因编辑技术在抗病毒植物种质创新提供参考。     

表达A型H5N1血凝素的重组副流感病毒5能使小鼠抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的攻击

安全有效的疫苗是阻止高致病性（HPAI）禽流感病毒H5N1在人群中大规模暴发的最好方法。目前FDA批准的H5N1疫苗有明显的局限性,因此,迫切需要更加有效的H5N1疫苗问世。副流感病毒5（PIV5）是一种副黏病毒,在人群中不引起任何疾病,因此是一种可行的疫苗载体。在我们的研究中,用单剂量的表达有来自-H5N1亚型病毒血凝素（HA）的重组活PIV5（rPIV5-H5）免疫小鼠,发现对致死剂量的HPAIH5N1攻击具有免疫作用。另外,我们试验了把H5N1HA插入到PIV5基因组中不同位置对PIV5制成的疫苗有效性的影响。有趣的是,当把H5N1的HA插在前导序列,即PIV5启动子和第一个病毒基因（其编码核蛋白NP）之间时,不能产生有活力的病毒。当把H5N1的HA插在NP和下一个基因V／磷蛋白（V／P）之间时,能引起病毒生长缺陷。当把H5N1的HA插在小疏水基因（SH）和血凝素-神经氨酸酶基因（HN）交界处时,其制成的疫苗对HPAIH5N1有最好的免疫力：在小鼠试验中,只要用1000PFU的剂量便已足够。本研究说明了表达有H5N1HA的重组PIV5有潜力成为HPAIH5N1的候选疫苗。     

具有生物安全性的杆状病毒杀虫剂基因工程技术的发展与前景

杆状病毒作为杀虫剂在世界各地已被广范应用．但与化学农药相比,杆状病毒具有杀虫速度慢,对高龄害虫需用量大,杀虫谱窄等缺点．随行基因工程技术的发展,从80年代末期起,科学家开始尝试对杆状病毒的遗传性状进行各种分子生物学改造,以获得更优良的病毒虫剂。近年来这方面的研究已取得了可喜进展,同时重组病毒的安全性也引起了世界范围的广泛关注。因此．研制既有优良杀虫性能,又有生物安全性的重组病毒．已成为当今病毒杀虫剂的发展方向。本文及时地总结了重组杆状病毒杀虫剂研究的历史,从提高病毒杀虫速度、增强病毒杀虫毒性、以及病毒宿主特异性等三个方面进行了系统归纳,并对重组病毒的安全性进行科学地分析。重点阐述了新时期研制具有生物安全性的重组病毒的各项基因工程策略,如对重组病毒进行混合包装、前包装：或生产缺陷型的重组病毒（p10基因,p74基因．egt基因,pp34基因的缺失）等。这些措施将把重组病毒对环境可能造成的危害控制在最小范围。理想的重组病毒杀虫剂应具有杀虫快、杀虫谱广、不危害其它生物、在环境中滞留时间短等特点。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一。本文通过构建p10缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能。利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因,然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上,构建了p10缺失的重组HaBacΔp10-PH-eGFP。重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装。     

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌[Cryphonectria parasitica(Murr.)Barr]的营养体亲和性基因及dsRNA病毒对菌株间病毒特征传播的影响。试验选用已知4个VC基因座位的15个Vc基因型菌株和3种dsRNA病毒,通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养,将病毒逐个转入不同Vc基因型菌株。将不同Vc基因型的含病毒菌株与具特定VC基因差异的野生型菌株配对培养,根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否,统计菌株间的病毒传播率。结果表明,各个VC基因对菌株间病毒传播的影响不同;存在2个VC基因差异的菌株间病毒传播率低于相差1个VC基因的：病毒在相差1个VC基因的菌株间的传播多具单向性：不同类型的病毒在菌株间的传播率也有差异。     

CELO病毒载体在人类和动物疾病控制上的应用

CELO病毒的DNA长43．8kb,具有末端倒转重复序列(ITR),基因结构与人腺病毒的比较,无可识别的E1、E3和E4区,但存在可替代的新读码框。2个fiber基因是病毒毒力基因,表达2个不同的蛋白,在病毒复制扩散中起作用,缺失fiberl导致柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的特异性转导作用消失,使CELO病毒只能感染禽类细胞,不能感染哺乳类动物细胞。在基因组的某些区段可以删除并插入外源基因不影响病毒复制。CELO病毒及其载体可在廉价的鸡胚中得到大量复制。CELO病毒的这些特性为其发展成新型基因工程载体提供了条件。插入表达外源基因制备疫苗成为可能,新型的无病毒基因的载体也可以应用ITR及一些调控元件、包装信号共同构建形成。CELO病毒与人腺病毒属于同一属,CELO病毒作为基因工程载体有同样的特性,并且具有种属特异性和安全性,在动物基因工程疫苗的研制方面有特殊而广阔的研究和应用前景。     

植物抗病毒基因工程及其应用前景

随着分子生物学的发展,特别是生物技术的广泛应用,利用新方法使植物获得抗性成为可能。最明显的表现是在植物抗病毒基因工程方面的长足发展。人们之所以把注意力集中到这个领域,不仅是因为提高农作物的抗病毒能力在农业生产中有重要意义,也是因为随着分子病毒学的发展,人们对病毒结构与功能之深入了解,使得病毒目的基因的鉴定、分离和克隆较为容易。据Gasser和Fraley(1989)的报道,在美国最近几年几乎每年都有几种通过基因工程获得具抗病毒能力的转基因植物进行田间试验。本文简要介绍目前植物抗病毒基因工程的几种策略及其应用前景。     

转录后基因沉默--植物抵御外来病毒入侵的一种机制

基因沉默是近几年来在转基因植物中发现的一种后生遗传现象。基因沉默大体可以分为两类：位置效应引起的基因沉默和同源依赖的基因沉默。其中,同源依赖的基因沉默又可以分为转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默的发现使得人们对植物和病毒的相互关系有了一个新的认识。基因沉默研究中所发现的转录后基因沉默现象是植物抵御病毒入侵、保持自身基因组完整性的一种防御机制,是植物与病毒共进化的结果。对于沉默产生的机理,尤其是转录后基因沉默,已经提出不少模型,但是都未能较全面地解释基因沉默中出现的各种实验现象。该文现就实验所取得的相关结果、转录后基因沉默机制和植物对病毒防御机制的相互关系,以及其研究进展进行综述。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一.本文通过构建p10 缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能.利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因, 然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上, 构建了p10缺失的重组HaBacΔp10- PH-eGFP.重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装.