临床级脐带间充质细胞制备及鉴定方法研究

目的在GLP实验室中制备并鉴定临床级脐带间充质细胞(UC-MSC)。方法新鲜获取的脐带去除血管并进行充分清洗,获得的华通胶(Wharton’s jelly)机械分离后分别进行直接贴壁法和不同的酶消化法,比较获取UC-MSC的数量差别;用不同的无血清培养基进行培养比较细胞形态是否良好,得到最佳形态的UC-MSC。体外培养第3代后进行UCMSC质检,包括细胞活性,生长曲线,无菌检测,人类相关病毒、支原体、内毒素检测,染色体核型分析,FACS免疫表型检测及分化能力检测。不同消化方法获取细胞数之间比较采用两样本配对t检验。结果胶原酶Ⅱ消化获得的UC-MSC数(5.3×10~6±0.58个/ml)与胶原酶Ⅰ+0.25﹪胰酶消化法(2.53×10~5±0.03个/ml)及直接贴壁法(2.6×10~5±0.05个/ml)之间差异有统计学意义(P0.05),与胶原酶Ⅰ消化法获取细胞数(5.1×10~6±0.57个/ml)之间差异无统计学意义(P=0.07),但培养视野最干净;Mesen Cult-ACF Medium培养获得的UC-MSC形态最佳;UC-MSC质检细胞活性冻存前达99.8﹪,冻存复苏后达99﹪;无细菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒、肺炎支原体、EB病毒、巨细胞病毒污染;内毒素检测结果均1 EU;CD73/CD90/CD10~5阳性率达98﹪,CD34/CD45/HLA-DR呈阴性,阳性率2﹪;染色体核型分析无突变或缺失;UC-MSC具有成脂、成骨或成软骨方向分化的能力。结论通过优化分离和培养条件,采用无血清及无动物来源的培养系统,在GLP实验室内可获得临床级UC-MSC。     

小型猪ASCs生物学性状研究及其骨组织工程应用探讨

目的:观察小型猪脂肪来源干细胞(adipose derived stem/stromal cells,ASCs)的形态学特点,研究其多向分化潜能和生物学特性,探讨其在骨组织工程方面的应用。方法:切取雄性小型猪背部皮下脂肪,体外分离培养并鉴定ASCs,观察其生长、增殖特性和组织学形态;并诱导其向脂肪细胞和骨细胞多向分化,分别采用油红O染色和茜素红染色鉴定,细胞表面分子通过流式细胞术鉴定。结果:贴壁的ASCs为长梭形,生长增殖快,性状稳定,流式细胞术检测显示CD29、CD90阳性表达,CD14、CD31、CD34阴性表达。通过相应的诱导培养液诱导,ASCs可向脂肪细胞和骨细胞分化并表现出相应的生物学特征。结论:小型猪背部皮下脂肪取材方便,可获得大量脂肪用以分离ASCs,ASCs增殖分化能力较强,在条件培养基诱导下可成骨分化,可作为种子细胞应用于骨组织工程。     

人大隐静脉干细胞原代培养方法的改良

旨在探讨如何高效获取优质的人大隐静脉(Great saphenous vein)原代干细胞。大隐静脉剪碎后分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型胶原酶消化法获取血管壁细胞。倒置显微镜下观察不同时间段两组血管壁细胞形态学变化,台盼蓝染色测定血管壁细胞存活率,流式分选CD34和CD117双阳性干细胞,免疫荧光进一步证实。细胞培养至第三代(P3)时组织块贴壁法提取的细胞出现纤维化老化,而酶消化法提取的细胞仍有集落样生长,细胞存活率分别为(91.7±1.2)%和(97.2±0.7)%(P=0.005)。流式分选结果显示:组织块法和酶消化法获得CD34和CD117双阳性细胞所占比例分别为(0.16±0.05)%和(0.44±0.07)%,差异有统计学意义(P=0.005)。免疫荧光染色显示,分选出的干细胞培养1周后组织块法获得双阳性干细胞的阳性率(89.41±2.06)%,酶消化法为(94.03±1.83)%,P0.05。流式细胞仪检测分选出的干细胞中CD31、VEGF2和SMA阳性率分别为(0.12±0.01)%、(0.19±0.02)%和(0.45±0.01)%,与阴性对照组差异无统计学意义(P0.05),排除成熟内皮细胞和平滑肌细胞存在的可能性。分选出的干细胞进行管腔形成实验进一步证实其具有向内皮分化的潜能。上述结果显示,采用酶消化法可以获得形态更好、数量更多、存活率相对更高的干细胞,可广泛用于临床和基础研究。     

大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立

目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型。方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预。免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1%O2,5%CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况。结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达NG2+A2B5,且可分化为MBP阳性的OL。OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,Ed U染色阳性率明显降低。结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力。2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间。     

人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况。方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测。应用油红"O"染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定。结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。培养至第3代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第7代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红"O"染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin。结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,m UCMSCs)探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法通过贴壁培养法将m UCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的m UCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的m UCMSC,可见红色结节。结论贴壁培养法分离培养所获得的m UCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

小鼠间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞miRNA表达的变化

目的：探讨小鼠间充质干细胞（MSCs）定向诱导分化成脂肪细胞微小RNA（miRNA）表达的变化,为进一步研究miRNA调控MSCs向脂肪细胞分化的分子机制奠定基础。方法：采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL／6小鼠MSCs,形态学观察细胞生长情况,并用免疫组化方法鉴定细胞表面抗原CD29、CIM4和CD34的表达。脂肪细胞分化诱导剂诱导MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色,判断MSCs成脂分化情况。运用rrfiRNA芯片技术检测MSC8和脂肪细胞中差异表达的miRNA。结果：①倒置显微镜下观察,传5代后可获得均一性较高的MSCs;免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性。MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性;②基因微阵列分析表明,小鼠MSCs分化成脂肪细胞差异表达的miRNA共75个,其中20个表达上调、55个表达下调。结论：MSCs分化成脂肪细胞存在miRNA表达的变化,某些miRNA很可能具有重要的调控MSCs成脂分化的作用。     

大鼠BMSCs条件培养基对NSCs形态、生长及分化的影响

通过对SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)及新生鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行体外分离、培养及鉴定后,观察BMSCs条件培养基对NSCs向神经细胞分化的影响。采用全贴壁培养法培养BMSCs,并采用流式细胞术鉴定其特异性表面抗原标记。无血清技术培养NSCs,采用免疫荧光技术鉴定其特异性抗原标记。BMSCs条件培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养基)对NSCs诱导7 d后,镜下观察细胞形态和生长,并采用免疫荧光技术检测NSCs分化。BMSCs高表达CD90、CD29(90%),而CD45呈阴性表达。免疫荧光染色显示,NSCs标记蛋白Nestin、SOX2为阳性。NSCs经BMSCs培养液诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为73.80%和50.47%;NSCs经胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为42.14%和31.90%。BMSCs条件培养基可诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中BMSCs分泌的细胞因子在诱导分化中可能发挥重要作用。     

miR-30a-5p对人肝癌干细胞增殖和凋亡的影响

目的采用mi R-30a-5p模拟物转染CD133~+MHCC97L肝癌干细胞,观察增殖和凋亡能力的变化,明确mi R-30a-5p对肝癌干细胞的基因治疗效果。方法采用免疫磁珠分选法分选CD133~+MHCC97L肝癌干细胞并采用流式细胞术检测分选效果。分别采用mi R-30a-5p模拟物或抑制物转染肝癌干细胞设为30 a M组或30 a I组,并设立空白对照NC组。采用RT-PCR法检测细胞mi R-30a-5p表达水平。采用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。肝癌干细胞分选效率、mi R-30a-5p表达水平、CCK-8实验测得A值、克隆形成数量和细胞凋亡率实验数据的比较采用单因素方差分析和t检验。结果未进行磁珠分选的MHCC97L肝癌细胞CD133阳性率为(1.42±0.26)﹪,低于分选后的MHCC97L细胞中CD133的阳性率(94.48±2.32)﹪,差异具有统计学意义(t=-6.78,P=0.04)。RT-PCR实验结果显示,30a M组CD133~+MHCC97L肝癌干细胞中mi R-30a-5p的相对表达水平(20.21±1.92)较NC组(1.03±0.02)明显上调;30 a I组的相对表达水平(0.13±0.01)较NC组明显下调,差异均具有统计学意义(t=20.96,-6.22;P=0.01,0.03)。CCK-8实验结果显示,30 a M组细胞于24 h、48 h和72 h测得的A值分别为(0.40±0.00,0.68±0.03,0.75±0.02),明显低于NC组的(0.83±0.01,1.34±0.03,2.47±0.12),差异具有统计学意义(t=-12.15,-15.66,-6.42;P=0.01,0.02,0.01);30a I组细胞测得的A值分别为(0.95±0.05,1.64±0.03,3.28±0.07),明显高于NC组,差异具有统计学意义(t=9.45,18.97,7.58;P=0.00,0.01,0.03)。软琼脂克隆形成实验结果显示,30 a M组细胞的克隆形成数量为(61.81±1.76)个/孔,低于NC组的(131.96±8.15)个/孔,差异具有统计学意义(t=-8.31,P=0.00);30 a I组的克隆形成数量为(195.75±6.16)个/孔,高于与NC组,差异具有统计学意义(t=15.61,P=0.01)。流式细胞术结果显示,30 a M组的细胞凋亡率为(19.67±0.06)﹪,高于NC组的(10.65±0.12)﹪,差异具有统计学意义(t=15.90,P=0.02);30 a I组的细胞凋亡率为(4.85±0.03)﹪,低于NC组,差异具有统计学意义(t=-6.96,P=0.00)。结论 mi R-30a-5p对CD133~+MHCC97L肝癌干细胞的增殖具有明显的抑制效果,有望成为针对肝癌的有效靶向性治疗手段。     

毛囊干细胞体外诱导成血管内皮细胞的实验研究

目的建立简单、可靠的毛囊干细胞体外定向分化为血管内皮细胞的方法。方法无菌条件下切取1周龄SD大鼠触须部皮肤,Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,改良的组织块贴壁法培养rHFSCs,差速贴壁法纯化,流式细胞仪检测及细胞免疫荧光染色联合鉴定。用含10 ng/ml和20 ng/ml VEGF165作为主要诱导因子将细胞分为两种浓度组别,不传代的情况下分别在1、2、3周内观察诱导后细胞形态;通过流式细胞和细胞免疫荧光染色检测分化效率;选取最佳诱导因子浓度和工作时间,对诱导后的细胞进行体外官腔形成实验,并在透射电镜下观察W-P小体。流式细胞术检测分化效率实验数据的比较采用单因素方差分析及独立t检验。结果分离、培养、纯化的rHFSCs克隆能力好,活力强,生长曲线呈S型。流式细胞及免疫荧光染色联合检测β1(98.9%)、α6整合素(97.9%),CK15(68.1%)、P63(98.5%)呈高表达,阴性表达CD31(13.6%)、VE-cadherin(17.9%)。在诱导液的作用下,两组细胞从1周到3周后,均由扁平铺路石样改变到完全被长梭形样细胞占据。流式细胞及免疫荧光染色检测CD31和VE-cadherin显示,CD31在诱导1周时表达最强,两种诱导因子比较无差异[(65.27±0.57%)vs(66.13±0.60)%,t=1.812,P=0.145]。而VE-cadherin在诱导1周时表达也最强,10ng/ml要优于20ng/ml VEGF165的诱导作用[(95.57±0.85)%vs(78.10±1.25)%,t=19.977,P=0.001]。10 ng/ml VEGF165诱导1周后的细胞体外管腔形成实验阳性,在透射电镜下可以观察到内皮细胞特有结构W-P小体。结论毛囊干细胞体外在10ng/ml VEGF165的诱导下,1周后可成功得到性能良好的血管内皮细胞。可为组织工程血管、细胞移植治疗缺血性疾病等提供理想的种子细胞。     

丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响分析

目的探讨丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响。方法选自第三军医大学第一附属医院2014年6月至2016年6月期间收治的急性重度一氧化碳中毒患者94例,依据随机数字表法分为观察组47例与对照组47例。对照组给予神经节苷脂治疗,观察组在对照组基础上结合丁苯酞治疗。两组疗程均为4周。比较两组治疗疗效、24 h血乳酸清除率、一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)发生率,治疗前后GCS评分和免疫功能指标变化。组间和组内计量资料两两比较采用t检验,等级计数资料的比较采用卡方检验。结果观察组治疗总有效率(93.62﹪)高于对照组(74.47﹪)(c~2=6.425,P0.05);两组患者治疗后GCS评分增加(P0.05);观察组患者治疗后GCS评分(14.23±1.69)分高于对照组(11.35±1.45)分,差异具有统计学意义(t=8.867,P0.05);观察组24 h血乳酸清除率(65.98±4.52)﹪高于对照组(41.39±3.67)﹪,差异具有统计学意义(t=28.954,P0.05);两组治疗后CD3~+、CD4~+、CD4(+CD8~+)增加,而CD8~+降低(P0.05);观察组治疗后CD3~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.64±0.31)﹪高于对照组CD3~+(57.12±3.76)﹪、CD4~+(38.91±3.10)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.34±0.24)﹪,而CD8~+(25.78±2.18)﹪低于对照组(29.08±2.31)﹪,差异具有统计学意义(t=6.308、4.755、5.246、7.123,P0.05);观察组DEACMP发生率(4.26﹪)低于对照组(23.40﹪),差异具有统计学意义(c~2=7.231,P0.05)。结论丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者疗效明显,可提高乳酸清除率,改善患者免疫功能,具有重要研究意义。     

培养人皮下脂肪干细胞纵向分化的实验研究

目的:建立人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分离、培养的方法,观察其生物学特性,探讨其纵向分化的能力.方法:自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.以含有胰岛素、地塞米松、1.甲基-3-异丁基-黄嘌呤的无血清混合培养基诱导其向脂肪细胞纵向分化,以细胞形态学变化.油红O染色和测定甘油磷酸脱氢酶活性判定分化是否成功.结果:人皮下脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪干细胞,诱导培养7d后细胞由梭形逐渐变圆,胞质内出现脂滴后逐渐增多融合为脂泡,并与甘油磷酸脱氢酶活性变化相吻合.油红O染色显示约(78.6±2.2)%细胞转变为脂肪细胞.结论:人皮下脂肪中分离的脂肪干细胞在体外诱导条件下能纵向分化为脂肪细胞,可能成为修复软组织缺损及整形美容的又一干细胞来源.     

免疫磁珠分离淋巴细胞在流式交叉配型试验中的应用及研究

目的探讨免疫磁珠快速分离法及密度梯度离心(Ficoll)分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)在流式细胞交叉配型中的应用比较。方法取10例交叉配型供体外周抗凝血各10 ml,受体非抗凝血5 ml,分别采用密度梯度离心与免疫磁珠阴性选择试剂盒从相同体积的抗凝血中分离PBMC。用血细胞计数比较两种方法分离的WBC、PLT、RBC粒度分布和PBMC中淋巴细胞的纯度;用细胞流式和淋巴细胞表面标记荧光抗体检测两种方法分离得到的PBMC中T、B和NK细胞的数量质量;将免疫磁珠阴性分离和密度梯度离心法分离的供者PBMC与受者血清共孵育,加入羊抗人IgG-FITC,洗涤后加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC单克隆抗体,再用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果免疫磁珠阴性分离的PBMC数量是Ficoll分离PBMC的0.42倍,但淋巴细胞的比例[(99.2±0.08)﹪]高于PBMC分离的淋巴细胞比例[(82.5±5.27)﹪(t=9.91,P0.01)],且两种方法分离的PBMC中RBC分别为(0.001±0.001)×10~6/μl和(0.02±0.009)×10~6/μl(t=6.64,P0.001);血小板的数量分别为(1.00±0.05)×10~3/μl和(196.00±4.21)×10~3/μl差异均有统计学意义(t=146.46,P0.01)。流式细胞检测免疫磁珠分离的PBMC中CD3~+T细胞为(81.33±4.60)﹪,CD19~+B细胞为(8.41±0.87)﹪,CD3-CD56~+NK细胞为(9.35±0.67)﹪和CD3~+CD56~+NKT细胞为(2.47±0.07)﹪。而Ficoll分离的PBMC中CD3~+T细胞为(37.36±3.27)﹪,CD19~+B细胞为(5.79±0.94)﹪,CD56~+NK细胞为(6.60±0.91)﹪,且差异均有统计学意义(t=24.64、6.470、7.70、51.31,P均0.01)。T和B淋巴细胞流式交叉配型试验中,设门定量读取T和B淋巴细胞与受者血清中抗体结合情况,密度梯度离心获得的淋巴细胞中混有血小板等,使流式检测结果中会混有假阴性,而免疫磁珠分离法没有出现假阴性结果。证明免疫磁珠分离的PBMC可应用于临床交叉配型试验。结论免疫磁珠阴性选择分离全血PBMC,用时短,纯度高,去除了99﹪的血小板,不混有红细胞、血小板,是一种优于Ficoll分离PBMC的新方法。     

脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究

目的:探讨脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化情况。方法:选取10只SPF级雄性SD大鼠,将其不同部位的脂肪组织取出,分别采用不同方法对其向成骨、成脂及成神经等方向进行诱导分化并对其结果进行鉴定。结果:ADSC表达中,CD29占(99.11±0.13)%,CD44占(95.94±0.71)%,CD45占(0.12±0.09)%。经4周的成骨诱导后,茜素红S染色在细胞团中央发现红色钙化结节存在,碱性磷酸酶染色在细胞的胞质内观察到紫红色颗粒,经7d成脂诱导后,油红"O"染色在细胞质内观察到橙红色脂滴;经过6d的神经干培养基诱导后,通过免疫荧光染色证明诱导的Nestin细胞、神经丝蛋白-200以及GFAP等均出现阳性表达。结论:ADSC具备向脂肪、成骨及神经元等细胞进行多向分化的潜能,具有来源广、易于操作、体外增殖快速等优越性,并且不存在免疫排斥及医学伦理学问题,发展前景广阔。     

人尿源干细胞的提取和鉴定

目的从正常人尿液中分离得到具有增殖和分化能力的人尿源干细胞(h USC)。方法收集16例健康成人新鲜尿液,分离培养得到贴壁细胞,显微镜观察拍照。WST-1检测并绘制细胞生长曲线。流式细胞术分析细胞表面分子表达率。成骨和成脂诱导培养基诱导h USC分化。结果采用优化的细胞培养基得到12株具有较快增殖能力的h USC。分离的细胞中表达CD13、CD29、CD73、CD105的细胞数目均大于97﹪,表达CD90的细胞数目不足50﹪,表达造血系表面抗原CD14、CD19、CD34、CD45,内皮细胞表面抗原CD31以及HLA-DR的细胞数目均小于1﹪。h USC经诱导可分化成为骨和脂肪细胞。结论采用本研究自建培养体系可培养得到形态单一、具有较强增殖分化能力的人尿源干细胞。     

重组人MG53蛋白对人脐带间充质干细胞氧化损伤的保护作用

目的建立人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)的H_2O_2氧化损伤模型,探讨重组人MG53蛋白(rh MG53)对h UC-MSCs氧化损伤的保护作用。方法使用组织块培养法从健康人脐带沃顿胶组织中分离培养h UC-MSCs,流式细胞仪检测细胞表型;CCK-8法检测h UC-MSCs的增殖和H_2O_2损伤程度。实验分为正常对照组(NC组)、rh MG53组、H_2O_2组和H_2O_2+rh MG53组。分别采用CCK-8法、Transwell小室、流式细胞术和β-半乳糖苷酶染色检测rh MG53蛋白对h UC-MSCs增殖、迁移、周期凋亡和衰老的影响。各组、各个时间点的吸光值采用析因设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析。结果 h UC-MSCs贴壁呈梭型生长,高表达间充质干细胞标志CD44、CD133、HLA-ABC,低表达CD34、CD45;H_2O_2对h UC-MSCs具有浓度和时间依赖性的损伤作用,确定200μmol/L的H_2O_2处理16 h为h UC-MSCs氧化损伤的最适条件。与NC组相比,H_2O_2组细胞增殖(0.994±0.011 vs 1.331±0.014)、迁移率(8.15﹪±2.47﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)和S期细胞比例(29.67﹪±3.69﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)显著降低,细胞衰老(44.07﹪±5.26﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(52.63﹪±5.76﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著增加,差异具有统计学意义(均P0.05);rh MG53组细胞增殖(1.509±0.086 vs 1.331±0.014)和迁移率(52.13﹪±5.46﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)显著提高,S期比例(35.27﹪±4.79﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)变化差异无统计学意义(P0.05),细胞衰老(3.92﹪±1.31﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(3.96﹪±1.06﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。与H_2O_2组相比,H_2O_2+rhMG53组细胞增殖(1.252±0.056 vs 0.994±0.011)、迁移率(18.93﹪±3.12﹪vs8.15﹪±2.47﹪)和S期比例(34.84﹪±3.45﹪vs 29.67﹪±3.69﹪)显著提高,细胞衰老(17.89﹪±2.64﹪vs 44.07﹪±5.26﹪)和凋亡比例(4.65﹪±1.23﹪vs 17.63﹪±2.56﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。结论 rhMG53对H_2O_2造成的h UC-MSCs氧化损伤有保护作用。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的：研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果：纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论：分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的:研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果:纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论:分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

自体CIK细胞治疗21例中晚期恶性实体瘤的肿瘤标志物变化观察

目的观察自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）过继免疫疗法治疗中晚期恶性实体肿瘤的临床疗效及肿瘤标志物变化,初步对该疗法作出评价。方法取中晚期恶性实体肿瘤患者自体外周血50ml,根据文献报道方法体外诱导扩增CIK细胞。培养约14d后,一次性回输入患者体内,观察患者CIK细胞回输前2周及回输后4周左右外周血免疫指标变化、肿瘤标志物变化、生活质量及Karnofsky评分变化,随访1年观察1年生存率。采用t检验及寿命表法进行统计分析。结果在21例接受CIK回输治疗的患者中,治疗前出现有代表意义的肿瘤标志物异常升高的患者有14例,1次回输后有8名患者出现肿瘤标志物下降,其中1名患者降至正常范围;免疫指标在CIK细胞回输后4周较回输前2周均无有统计学意义,其中CD3由70.81﹪±10.52﹪升至71.91﹪±11.09﹪,t=0.762,P=0.455;CD4由39.06﹪±11.03﹪升至39.21﹪±8.74﹪,t=0.093,P=0.927;CD8由28.75﹪±8.22﹪升至29.88﹪±10.13﹪,t=0.895,P=0.382;CD16^＋CD56^＋（即NK细胞）由15.73﹪±9.52﹪升至15.37﹪±6.66﹪,t=-0.173,P=0.865;EORTCQLQ-C30（vertion3.0）评分中总体健康状况（globalhealth）由（41.67±17.28）分上升至（46.43±17.19）分,P=0.076;以上各指标治疗前后差异均无统计学意义。但功能子量表中的躯体功能（physicalfunctioning）单项[由（62.94±17.48）分上升至（66.67±17.37）分,P=0.012]和症状子量表中的疲倦（fatigue）[由（51.33±20.03）分下降至（43.38±16.81）分,P=0.012]、疼痛（pain）[由44.44﹪±19.24﹪下降至（36.51±14.55）分,P=0.038]及食欲丧失（appetiteloss）[由（52.38±19.92）分下降至（38.09±21.82）分,P=0.016]单项差异均有统计学意义（P〈0.05）;卡氏评分由[（61.42±3.59）分上升至（62.38±4.36）分,t=1.000,P〉0.05];随访1年内有3名患者死亡,生存率约85.7﹪。结论自体CIK细胞回输治疗后肿瘤标志物有明显改变,同时对缓解晚期恶?     

脐带间充质干细胞成脂分化的研究

目的:探讨脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供一种来源丰富的干细胞来源。方法:采用胰酶和胶原酶Ⅰ型联合消化法获得脐带间充质干细胞,通过免疫细胞化学法对其表面标志物进行鉴定,化学诱导方法诱导脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化,倒置显微镜观察其形态变化,油红O染色对诱导后的细胞进行染色。结果:胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化法分离的细胞贴壁生长,呈现成纤维细胞形态,免疫细胞化学显示脐带间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,但不表达CD31、CD34和CD105,脐带间充质干细胞在成脂诱导培养基中细胞生长速度明显减慢,细胞形态转变为肥大、扁平、含有大量脂滴的脂肪细胞,油红O染色示胞浆充满了油滴空泡。结论:脐带间充质干细胞具有向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供了一种来源丰富、免疫力低和低分化的种子细胞。