表达人γ-干扰素的重组腺病毒的制备及检测

El区缺失的腺病毒载体插入人γ-干扰素cDNA序列．与pJM17质粒通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞．经同源重组．共获得6个病毒噬斑。经PCR共扩增检测．证实这6个噬斑均为带有人γ-干扰素cDNA的重组腺病毒;受其感染的293细胞的上清中,都能洲到γ-干扰素的活性,且这种活性可被一定稀释度的兔抗人γ-干扰素多克隆抗体所中和。其中的1号重组病毒纯化后,接不同的M()I(Multiple of infection)值感染复制缺陷型腺病毒不能在其中增殖的B16F10细胞,未出现细胞病变效应(cytopalhic effect,CPE)．而上清中的γ-干扰素活性却随M()I值增大而升高,这证实构建的复制缺陷型腺病毒是能表达井分泌人γ-干扰素的。     

端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响

应用反义核酸技术,将端粒酶ＲＮＡ的ｃＤＮＡ反向插入整合型腺病毒载体ｐＡｄＥ１ＣＭＶＩＴＲＥＸｎｅｏ,与ｐＢ－ＨＧ１１Ｘ共转染２９３细胞反获得反义重组病毒。将此反义重组病毒感染乳腺癌细胞ＭＣＦ－７后,使细胞端区长度缩短。     

GDNF重组腺病毒的构建及促进多巴胺能神经元存活的研究

利用体内同源重组原理,构建了能介导ＧＤＮＦ基因转移和表达的复制缺陷型重组腺病毒ＡｄＣＭＶｇｄｎｆ,其中ＧＤＮＦｃＤＮＡ插入腺病毒基因组的Ｅ１区并由ＣＭＶ启动子控制在人２９３细胞内通过同源重组包装生成重组腺病毒后,用形态学方法、病毒ＤＮＡ酶切分析、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法进行鉴定正确．经测定病毒滴度达到１０１０ｐｆｕ／ｍｌ．用免疫沉淀方法从重组腺病毒感染的２９３细胞及其培养基上清中均检测到大量ＧＤＮＦ蛋白．用重组腺病毒直接感染或者用其条件培养基处理,分别使胚胎大鼠中脑原代多巴胺能神经元的数目增加８８．２％和９６．４％,明显增加多巴胺能神经元存活,对帕金森氏病基因治疗具有重要意义     

复制缺陷型腺病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在体内外的高效转移和表达

为了构建含人凝血因子Ⅷ基因的重组腺病毒载体系统,首先构建了含ＦⅧ（Ｂ结构域缺失型）的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ和插入内含子结构的ｐＡｄＩ－ｈＦⅧ,经脂质体介导,证明两质粒的目的基因均能在ＣＯＳ－７细胞中表达有凝血活性的ＦⅧ因子,其中经纯化的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ与ｐＢＨＧ１０经脂质体介导,共转染至２９３包装细胞,经同源重组和Ｅ１蛋白反式互补,形成Ｅ１／Ｅ３缺失型重组腺病毒载体颗粒Ａｄ－ｈＦⅧ．ＰＣＲ检则到病理２９３培养液上清的病毒ＤＮＡ中具有目的基因扩增片段,证明病毒ＤＮＡ含有ＦⅧ基因．经扩增、纯化、滴度测定,用于感染离体细胞ＣＯＳ－７、Ａ５４９、Ｌ９２９、２９３．证实该病毒能在上述细胞中高效转移和表达目的基因,其表达量具有一定范围内的剂量依赖性．ＣＯＳ－７细胞中,ＭＯＩ＞１０００时,有细胞毒效应,表达量反而下降．经耳缘静脉注射Ａｄ－ｈＦⅧ至家兔后,１～４周能测到一定水平的ＦⅧ蛋白,１周内升至最高峰．免疫组化研究表明感染的离体细胞和家兔肝等组织均有ＦⅧ表达,其中肝脏表达最高．为甲型血友病的基因治疗开辟了新途径     

重组腺病毒介导的白细胞介素—12（IL—12）在肝癌细胞中的表达

利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）。ＩＬ－１２的Ｐ３５和Ｐ４０ ｃＤＮＡ分别克隆到腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ,构建ｐＡＣ／Ｐ３５和ｐＡＣ／Ｐ４０表面质粒。与腺病毒重组质粒ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,通过基因重组产生ＩＬ－１２Ｐ３５和Ｐ４０重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１,经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ检测证明,     

以粘粒为基础产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研究

将总长度为１５２ｋｂ的单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）（１７株）基因组分成５个相互间有部分重叠的大片段（约３５－４０ｋｂ）,分别克隆到粘粒ＳｕｐｅｒＣｏｓＭＷ中,依次称为ｃｏｓ４８、ｃｏｓ２８、ｃｏｓ６、ｃｏｓ１４和ｃｏｓ５６（ＤａｖｉｓｏｎＡＪｅｔａｌ,１９９３）。此５个粘粒用ＰａｃⅠ切去粘粒骨架后共转染细胞,可发生同源重组而产生野生型ＨＳＶ－１。以此为基础,利用粘粒ｃｏｓ５６的ＨＳＶ－１ＵＬ４４基因中含有一个ＸｂａⅠ单一酶切位点的特点,将一个两端加有ＸｂａⅠ位点的ＣＭＶ－ｌａｃＺ－ｐｏｌｙＡ片段插入其中,构建成ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ。将ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ与其它４个粘粒经ＰａｃⅠ酶切后,用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂共转染ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２－３天,开始出现细胞病变及噬斑。５天后将病变细胞连同培养液一起冻融３次,取上清０．１ｍｌ感染新鲜的ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２４小时,用Ｘ－ｇａｌ染色３０－６０分钟,镜下观察可见大量蓝色噬斑。蓝色噬斑数占噬斑总数的５０％以上。经空斑纯化的蓝斑病毒可稳定传代。这种方法同将外源基因表达盒插入ＨＳＶｔｋ基因中构建成重组质粒,再与ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ共转染细     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。     

腺病毒介导犬干扰素-γ基因的表达及其体外抗犬细小病毒的作用

[目的]构建含犬干扰素-γ(c IFN-γ)基因的重组腺病毒,并在培养的犬肾细胞MDCK中分析其抗犬细小病毒的活性.[方法]首先将cIFN-γcNDA基因克隆到腺病毒穿梭质粒中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒穿梭质粒pShuttle3-cIFN-γ.利用特异的酶切位点,通过直接连接法将cIFN-γ表达盒插入到腺病毒基因组质粒pAdeno-X中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒基因组质粒pAd-cIFN-γ.pAd-cIFN-γ质粒经酶切线性化后转染人胚胎肾细胞HEK293T,在细胞中拯救出含有cIFN-γ基因的复制缺陷型重组腺病毒.然后用该重组腺病毒处理(感染)培养的犬肾细胞MDCK,再用犬细小病毒感染重组腺病毒处理的细胞,分析重组腺病毒在体外抗犬细小病毒的活性.[结果]通过连接法构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,构建的重组腺病毒能够介导cIFN-γ在MDCK细胞中进行分泌表达.用含cIFN-γ基因的重组腺病毒处理MDCK细胞,可明显地抑制犬细小病毒在细胞中的增殖,表明构建的重组腺病毒具有明显的抗犬细小病毒的活性.[结论]构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,并证明该重组病毒在体外具有明显的抗犬细小病毒的活性.     

人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备

从人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）培养物中提取ＨＣＭＶ并抽提其ＤＮＡ,经限制性内切酶ＢａｍＨＩ完全消化后,与质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＳＫ重组建立了ＨＣＭＶ的ＤＮＡ文库,从此文库。中随机筛选出两个重组质粒（ｐＣＭＶ－１和ｐＣＭＶ－２）,用ＢａｍＨＩ分析证明其中所含的病毒ＤＮＡ片段的大小分别为１．０ｋｂ和７．５ｋｂ,将这两种质粒大量扩增纯化后,用光生物素进行标记作为探针,证明其只与ＨＣＭＶ反应,与正常人细胞ＤＮＡ及Ⅰ型和Ⅱ型单纯疤疹病毒ＤＮＡ无交叉反应。     

腹腔注射重组腺病毒诱导的免疫反应

为研究重组腺病毒接种实验动物后的免疫反应性,利用ＲＴ－Ｐ　Ｃ　Ｒ方法,从ＨＡＶ的ＲＮＡ中克隆了结构蛋白基因插入穿梭质粒ｐＸＣＸ２Ｎｏｔ　Ｉ,通过磷酸钙－ＤＮＡ共　沉淀技术,将复制缺陷型腺病毒载体与线形化的ｐＸＣＸ２－ＣＭＶ－ＨＡＶ共转染２９３细胞。一系列检测方法证明产生了重组腺病毒ｒＡｄＨＡＶ。纯化后的ｒＡｄＨＡＶ滴度为１×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ　,腹腔注射免疫昆明种小白鼠后,可诱导产生抗ＨＡＶ　ＩｇＧ和ＨＡＶ中和抗体。复制缺陷型腺病毒　可作为发展基因工程病毒疫苗载体的有效系统。     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-a,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α.该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107 TCID50/mL.RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础.     

Epstein－Barr病毒潜伏膜蛋白（LMP）基因在哺乳动物传代细胞中的表达

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有ＬＭＰ基因（ＢＮＬＦ１）３个外显子（ｅｘｏｎ）开放阅读框架（ＯＲＦ）的长１．８０ｋｂｐ的ＤＮＡ片段,和能分解ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的含有ＳＶ４０早期启动子和ＨｇｒｙｏｍｙｃｉｎＢ磷酸转移酶全基因（长１０２５ｂｐ）的ＤＮＡ片段（长１．６０ｂｐ）,同时重组于亚克隆载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（ｐＢＳ）中,并使该重组质粒ｐＢＳ－ＬＭＰ－Ｈｙｇ（长５７６７ｂｐ）在乳地鼠肾传代细胞（ＢＨＫ）中获得表达。ＢＨＫ细胞在经此重组质粒转染后,ＬＭＰ阳性细胞是２％,在ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ的持续压力下,ＬＭＰ表达细胞率可达２０％。３个月后,ＬＭＰ表达细胞逐渐减少。５个月后,不能测到ＬＭＰ表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ）实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗ＬＭＰ抗体。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。     

肿瘤坏死因子－α（TNF－α）对常见呼吸道病毒的抑制作用

用人重组肿瘤坏死因子－α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α,ＴＮＦ－α）和人天然α干扰素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α－,ＩＦＮ－α）在人胚胎肺纤维母细胞（ＨＥＦ）和Ｈｅｐ－２细胞系上对常见呼吸道病毒所致细胞病变抑制进行比较观察。病毒包括不同型别的腺病毒５株,单疱病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－Ｉ）１株,鼻病毒１株,仙台病毒１株,ＶＳＶ１株。结果提示ＴＮＦ－α和ＩＦＮ－α均具有广谱抗病毒活性。ＴＮＦ－α的抑毒作用能被ＴＮＦ－α申抗和ＩＦＮ－β单抗完全去除,被ＩＦＮ－α单抗部分去除ＴＮＦ－α的抗病毒效应。ＴＮＦ－－α中和试验的结果提示：ＴＮＦ抗病毒活性仍为ＩＦＮ－β诱生所介导。     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达１．２×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性ＣＦＵ－ＣＭ检测,其基因转移效率可达７．０％。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后４个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性     

表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到５型腺病毒载体质粒ｐＡＤ５Ｃ中。用此质粒与ＥｃｏＲＩ酶切回收的５型腺病毒基因组片段共转染２９３细胞,通过ＰＣＲ初步筛选得到重组病毒。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ实验证明能诱导小鼠产生针对流感的循环抗体ＩｇＧ和分泌型抗体ＩｇＡ。本实验证明,利用Ｅ     

江浙蝮蛇神经生长因子在家蚕幼虫中的表达

江浙蝮蛇神经生长因子（ＮＧＦ）基因克隆于昆虫病毒转移栽体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组转移栽体ｐＢａｃ－ＰＡＫ－ＮＧ〈与线性化Ｂｍ－ＡａｃＰＡＫ６修饰病基因组ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒。用重组病毒洒家蚕幼虫,５天后收集血淋巴,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测及利用ＰＣ１２细胞进行ＮＧＦ生物活力测定证明,神经生长因子在家蚕幼虫中得到较高表达,且表达产物具有良好的生物学活性     

HSV—tk／NAS系统基因治疗脑肿瘤中野生型腺病毒的检测及其安全性

在腺病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＮＡＳ系统脑肿瘤基因治疗研究过程中,建立了野生型腺病毒（ＲＣＡ）的检测系统,主要包括腺病毒Ｅ１区的ＰＣＲ以及野生型病毒的细胞病理效应观察这两种方法,ＰＣＲ的灵敏度为１个２９３细胞所含有的Ｅ１片段数。对基因治疗脑肿瘤所采用的重组腺病毒ＡｄＴＫ及其感染的细胞进行ＲＣＡ的检测,没有发现ＲＣＡ。通过离体实验首次发现,重组腺病毒对脑肿瘤细胞的杀伤作用明显高于正常的脑胶质细胞;大鼠     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫