焦化废水处理厂接触氧化池中降酚茵群的苯酚羟化酶大亚基基因多样性

研究了某焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因（the largest subunit of the multi-component phenol hydroxylase,LmPH）的多样性。通过温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE）对比分析了氧化池4个区段（O1-O4）中降酚菌群LmPH的组成。它们的TGGE图谱完全一样、相似性为100％,表明该处理池中不同区段的降酚菌群的功能基因组成是高度相似的。以O4段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库,从中挑选了49个克隆测序。依据LmPH基因的DNA序列所推测的氨基酸序列完全相同的归为一类的原则,49个克隆被分为16种类型,其中优势LmPH基因主要有5种类型（多于4个克隆）,而另外11种类型都只有1个克隆。与已知基因同源性超过90％的有7种类型,低于80％的有2种类型。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数（low-Ks）的LmPH,占所有克隆的92％。只有一个类型属于高亲和常数（high-Ks）的。因此,处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型,而且以编码低亲和常数的占优势地位,而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。     

高效苯酚降解菌细胞固定化方法与条件的研究

含酚废水是一种难降解有机废水,对环境污染非常严重。目前常利用细菌处理含酚废水。但利用细菌处理含酚废水存在一些缺点,为此将1株高效苯酚降解菌进行细胞固定化。采用正交实验设计方法确定了该菌株固定化的最佳条件,并且考察了该固定化细胞降解苯酚的最佳条件。实验表明:该菌株的固定化细胞降解苯酚能力和耐受苯酚能力均大于游离细胞,经36 h可将1 800 mg/L苯酚降解完全。其降解苯酚的最适温度为30℃,最佳pH值为5~9。     

克隆的概念,意义与进展

首先介绍了克隆在个体,细胞和分子水平的生物学定义,强调了克隆是一个“群体”概念。然后较为详细地讨论了分子克隆（ＤＮＡ克隆）和通过细胞核移植进行动态（小鼠）克隆的基本,意义,目前进展和有等回答的一些问题。     

两种丝状绿藻对水体中低浓度苯酚的去除作用研究

研究了两种丝状绿藻,脆弱刚毛藻(Cladophora fracta)和长形水绵(Spirogyra longata)对水体中低浓度苯酚(≤6mg·mL-1)的去除作用。结果表明,在不考虑交互作用下,脆弱刚毛藻和长形水绵对苯酚的去除率分别为86%和75.63%,脆弱刚毛藻去除苯酚试验中,温度是主要影响因素,长形水绵去除苯酚试验中,处理时间是主要影响因素;在考虑交互作用下,脆弱刚毛藻和长形水绵对苯酚的去除率分别为88.98%和75.63%,脆弱刚毛藻去除苯酚试验中,温度是主要影响因素,长形水绵去除苯酚试验中,处理时间是主要影响因素;脆弱刚毛藻去除苯酚实验中各因素最优水平组合为温度18℃,处理时间2h,藻重0.5g,长形水绵去除苯酚试验中中各因素最优水平组合为温度8℃,处理时间1h,藻重0.5g。     

书刊介绍

本书由美国“哈佛大学、密西根州立大学和冷泉港实验室等著名生物学家共同撰写。美国冷泉港实验室是当代世界上公认的水平最高的分子生物学实验室。分子克隆实验手册首版     

第一个阿片受体克隆成功

谢国玺博士最近从人胎盘中克隆出一个具有阿片结合活性的受体,这是第一个克隆成功的阿片受体。阿片受体的存在最早是于70年代初基于药理学实验提出的,以后许多实验室又对阿片受体的生化特性做了大量的研究,并纯化出一些不同分子量的阿片受体,进一步证实了阿片受体的存在。尽管这些实验室一直在致力于阿片受体的     

高效复合菌对氯代苯酚类化合物的微生物修复研究

从江苏省扬子石化公司污水处理厂曝气池出口处取活性污泥样品,驯化、培养、分离得到降解氯代酚类芳烃化合物的复合菌作为微生物源,采用细菌生长抑制法分别进行了2-氯苯酚、3-氯苯酚和4-氯笨酚的24h急性毒性试验,求得了相应的24h半数抑制浓度值及24h毒性效应-关系曲线.结果表明:所获得的复合菌群较自然水体中混合细菌对氯代苯酚有更强的耐受性.采用实验室摇瓶法得到了这三种受试化合物的生物降解曲线,对应的降解速率常数K分别为:2.氯酚K=0.0112(h.1)、3.氯酚K=0.0556(h-1)、4-氯酚K=0.0038(h-1);降解半衰期t1/2分别为61.9(h)、12.5(h)和182.4(h).三种化合物在100 h内均达到了降解平衡,且降解平衡时的降解率分别达到:2-氯酚56.3%,3-氯酚81.7%,4-氯酚36.4%,属于高效复合菌,发挥了微生物对外源性化合物的巨大降解和修复潜能.     

焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因多样性

研究了某焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因(thelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase,LmPH)的多样性。通过温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)对比分析了氧化池4个区段(O1—O4)中降酚菌群LmPH的组成。它们的TGGE图谱完全一样,相似性为100%,表明该处理池中不同区段的降酚菌群的功能基因组成是高度相似的。以O4段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库,从中挑选了49个克隆测序。依据LmPH基因的DNA序列所推测的氨基酸序列完全相同的归为一类的原则,49个克隆被分为16种类型,其中优势LmPH基因主要有5种类型(多于4个克隆),而另外11种类型都只有1个克隆。与已知基因同源性超过90%的有7种类型,低于80%的有2种类型。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数(low-Ks)的LmPH,占所有克隆的92%。只有一个类型属于高亲和常数(high-Ks)的。因此,处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型,而且以编码低亲和常数的占优势地位,而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。     

生物降解对黑碳及土壤上苯酚脱附行为的影响

农业土壤和黑碳(BC)两种不同的吸附剂吸附苯酚平衡后分离,每组一部分不做处理,另一部分通过加入无酚灭菌溶液脱附平衡后分离,制备得到在不同吸附位点上吸附有苯酚的两类不同类型的4种吸附苯酚的吸附剂,研究了在不同Pseudomonasputida ATCC 11172菌密度条件下吸附在这4种吸附剂上的苯酚的脱附行为.结果表明,土壤及BC对苯酚的吸附均呈现明显的非线性,可用Freundlich模型描述.吸附态的苯酚能否被微生物利用取决于微生物及吸附剂的性质,BC具有发达的微孔结构,微孔小于假单胞菌细胞尺寸,导致假单胞菌无法直接利用吸附在BC上的苯酚;土壤基本无微孔结构,微生物较易与吸附的苯酚发生表面接触,直接利用吸附态苯酚.BC和土壤上的吸附态苯酚的脱附行为能用三元位点模型很好地描述,模型计算结果表明BC上的苯酚脱附主要受慢速脱附和极慢速脱附控制,微生物降解速率受脱附控制,降解可加速BC上的慢速脱附和极慢速脱附;土壤上的苯酚脱附主要受快速脱附控制,微生物降解不受脱附速率限制,对土壤上的脱附行为基本无影响.     

大肠杆菌BL21(DE3)中定向进化突变体库构建的方法比较

定向进化的突变体库建立是定向进化是否成功的关键因素,只有建立足够大的库容才有可能筛选到合适的突变体。然而用来做定向进化的宿主菌的转化效率并不总是那么高,难以达到建库要求。而且在以常规分子克隆方法做连接转化时,耗时长,效率低等问题也影响了突变体库的建立,高效的克隆转化方法是定向进化所需求的。本文以大肠杆菌BL21(DE3)为转化宿主菌,挑选了一种新的高效的克隆转化方法,与现在实验室常规克隆转化方法进行了比较,证明了PCR多聚质粒的克隆转化方法在定向进化突变体库构建中的优势。为定向进化突变体库的构建提供了新的高效可靠的技术方法。     

一株高效苯酚降解真菌的分离鉴定及其菌剂的制备

【背景】含酚废水是普遍存在的有毒、难降解的有机污染物之一,生物法处理含酚废水因成本低、无二次污染而具有广阔的应用前景。可降解苯酚的微生物中,真菌比细菌对恶劣环境的适应性更好。针对液态菌液保存时间较短和运输困难的瓶颈,制备固体菌剂可以提高菌体存活率和储藏稳定性。【目的】筛选一株能够高效降解苯酚的真菌,优化其降酚性能并选择合适的载体制备菌剂。【方法】通过逐级驯化和纯化分离降酚菌,筛选得到降酚性能较强的真菌并通过ITS r DNA基因测序进行种属鉴定,通过参数优化进一步提高菌株降解苯酚的性能;以不同材料为载体制备菌剂,通过稀释平板计数法和苯酚降解实验探究菌剂在不同温度下的保存效果。【结果】分离筛选得到一株高效降解苯酚真菌QWD1,通过鉴定证明其属于Magnusiomyces capitatus,其最适降解条件:(NH_4)_2SO_4为氮源,接种量为15%,pH为7.0,温度为35°C,氮源浓度为14 mmol/L。在此条件下,28 d内对1 600 mg/L苯酚去除率可以达到97.15%;制备菌剂最合适载体为谷糠,适宜保存温度为4°C,保存时间可达到90 d甚至更长,活菌数高达2.5×10~8 CFU/g左右,降解苯酚效果良好。【结论】筛选得到了一株高效降解苯酚真菌,优化其降解性能并将其制备成菌剂,为处理含酚废水提供了新菌种和理论支持。     

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖,纯化,获得一株单一质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS－热酚法抽提,在使用低熔点琼脂凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMD18-T载体上。利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框（ORF）。推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株（BmCPV-I Istrain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86．0％和93．4％。     

3-苯氧基苯甲酸降解菌Sphingomonas sp. SC-1降解苯酚环境条件及其降解中间产物的研究

【目的】探究高效降解3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid,3-PBA)的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.) SC-1对苯酚的降解特性。【方法】采用HPLC测定微生物降解体系中苯酚残留量,考察环境条件对菌株SC-1降解苯酚的影响;分析不同培养时间苯酚降解体系混合样品的HPLC谱图,确定其降解中间产物。【结果】菌株SC-1能在基础盐培养基中以苯酚为唯一碳源和能源生长,在初始pH 7.0、30 °C条件下,24 h可完全降解100 mg/L苯酚;Cu2+、Ba2+、Mn2+等对其降解苯酚有不同程度的抑制作用;HPLC谱图分析,初步确定邻苯二酚是菌株SC-1降解苯酚的中间产物,且该菌株可在48 h内完全降解100 mg/L邻苯二酚。【结论】菌株SC-1对苯酚及邻苯二酚均有较强的降解能力,为完善3-PBA的降解途径及污染3-PBA或含酚废水或含酚农药残留的降解提供了数据参考。     

分子克隆实验指南精编版

《分子克隆实验指南》第3版作为一本准确、可靠、明确的实验操作手册,获得广泛的赞誉,已成为分子生物学工作者必备的案头工具书。第3版在前两版的基础上对图书内容进行彻底的更新,修改了每一个方案,增加了大量的新内容,拓宽了学科范围,涵盖了各类常规技术、成熟技术和新技术,这些实验技术都是目前世界范围内分离、分析和克隆DNA分子顶尖实验室日常工作中经常用到的。     

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)ast(anthocyanin spotted testa)突变体是由碳离子辐射诱导产生的与花青苷生物合成有关的基因突变体。受单隐性核基因控制。根据拟南芥数据库中的SNPs(single nucleotide poly-mophisms)序列和插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphisms)序列,设计了一系列分子标记,采用图位克隆策略。应用这些分子标记完成了对拟南芥AST基因的精细作图,成功地将AST基因定位到BAC克隆T13M11上,初步认为该BAC克隆中的基因T13M11.8可能是AST基因。该基因的DNA序列长1432bp。含有6个外显子和5个内含子,编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶有较高的同源性。将进一步通过功能互补实验验证图位克隆的结果。     

一步法快速质粒鉴定方法

对《分子克隆实验指南》(第三版)中的牙签法小量制备质粒DNA的方法做了改进,减少了 加样次数,免去冰浴、离心等步骤,改进后的方法在琼脂糖凝胶电泳前仅需一步加样和加热过程, 提高了实验效率。同时结合使用多孔道移液器和96孔板,更适合于在高通量筛选中鉴定阳性克 隆。实验对改进后的方法与《分子克隆实验指南》上的方法进行了比较,表明“一步法”的检测效 果、准确率与重复性均有到较好的结果。     

野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA的分子克隆及其特征

酚氧化酶在昆虫的免疫防御机制中起着重要作用。利用RT-PCR和RACE方法,克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因,获得了其cDNA序列。该序列长2 134 bp,含有一个2 082 bp的完整开放阅读框,编码一个由693个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。组织特异性表达分析表明了该基因在野桑蚕5龄幼虫的血细胞、体壁、头部、精巢、卵巢、脂肪体和中肠等组织及其不同的发育阶段均有表达。这些结果为进一步研究野桑蚕酚氧化酶原基因的功能提供了分子基础。     

克隆加转基因,相得益彰

“克隆”一词是外来语 ,是由英文“ｃｌｏｎｅ”一词音译而来的。克隆这一生物学术语 ,曾被我国生物学者意译为“无性系” ,除了专业人员外很少有人知道这词。随着近年来的“外洋文化潮流”的盛行 ,特别是英国克隆羊“多莉”出世的消息 ,经新闻媒体炒作 ,使克隆一词家喻户晓老幼皆知 ,广为流传。现在连商店名字都有叫‘万克隆’、‘亿克隆’ ,想必是老板们也想把利润大大地克隆克隆。在生物学上 ,克隆可以作名词或动词用。克隆用作名词时含义有三 :１、在分子水平上 ,克隆通常指ＤＮＡ克隆。克隆的含义是运用生物学技术 ,对某一特定的ＤＮＡ…     

一种新的DNA分子克隆方法

DNA分子克隆是基本的分子生物学实验技术,传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程,但在某些情况下,没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍.本文描述了一种新的分子克隆方法,称为不依赖酶切和链接的分子克隆（RLIC）.利用RLIC,将3种不同大小的DNA片段克隆到3种不同载体,证明了这种方法的有效性和可靠性.由于该方法不受限制性酶切序列限制,省去了酶切连接步骤,因此具有很大的灵活性和简便性,在分子生物学研究方面有广泛应用前景.     

赤红球菌二鸟苷酸环化酶基因的克隆、信息学分析和转录变化研究

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础。综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studio 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况。克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549。该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95 kD,是疏水性蛋白。无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181~316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点)。亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白。DGC中超过50%的氨基酸参与形成α螺旋结构。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用。qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍。研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关。