二甲双胍降低肥胖大鼠海马内PPARγ、IDE表达伴随TNF-α和Aβ42表达上调

二甲双胍（metformin,MET）常用于肥胖胰岛素抵抗患者改善胰岛素抵抗降低血糖,但MET可增加脑内β-淀粉肽（β-amyloid,Aβ）表达,目前机制不清.Aβ沉积作为阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD)始发病理生理学改变,在AD中发挥重要作用. 为研究MET对脑内Aβ表达的影响及机制,采用饮食诱导肥胖大鼠模型 （OB组）予MET灌胃4 W后（MET组）,观察海马内Aβ42及相关因子肿瘤坏死因子α （TNF-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、胰岛素降解酶（insulin degrading enzyme, IDE）的表达. 结果显示,OB组大鼠血糖水平较对照组（CTL组）无明显差异,胰岛素含量明显升高（P<0.01), 并存在胰岛素抵抗;OB组大鼠海马内TNF-α、 Aβ42 水平较CTL组上调,PPARγ、IDE表达下降(P<0.05). MET组胰岛素及胰岛素抵抗均较OB组降低(P<0.05),海马内TNF-α、Aβ42表达增加(P<0.01);PPARγ,IDE表达较OB组减少(P<0.01). 上述结果提示,二甲双胍作为治疗肥胖胰岛素抵抗的一线用 药,可改善胰岛素抵抗,但增加海马内炎性因子TNF-α表达、减少PPARγ水平,降低其调控IDE转录作用,使IDE表达减少,伴随Aβ42降解减少沉积增加,从而可能增加AD发病风险.     

Aβ1-42对大鼠小胶质细胞酸敏感离子通道的表达和电生理特性的影响

Aβ_1-42与小胶质细胞之间相互作用诱发的神经炎症反应已被视为阿尔茨海默病(AD)的重要病理指征,酸敏感离子通道(ASIC)参与了小胶质细胞的炎症应答和神经炎症免疫调节。为了探究Aβ_1-42对小胶质细胞ASIC的表达和电生理特性的影响,本研究利用Aβ_1-42孵育原代培养的SD大鼠大脑皮层小胶质细胞,免疫印迹技术和免疫荧光技术检测小胶质细胞ASIC1、ASIC2a、ASIC3的蛋白表达和分布情况,全细胞膜片钳记录Aβ_1-42对ASIC电流特性的影响,钙离子成像技术分析ASIC钙离子通透性的变化。结果显示：Aβ_1-42处理小胶质细胞后,能够诱导ASIC1的蛋白表达量增加,且其在细胞浆和细胞核中均有明显增加;胞外pH值快速降低诱发的ASIC电流,小胶质细胞胞内钙离子浓度明显增强,这种增强效应可被ASIC非特异性抑制剂阿米洛利和ASIC1特异性抑制剂PcTx1抑制。本研究结果表明,Aβ_1-42诱导小胶质细胞ASIC1蛋白功能性表达增加,使得ASIC1易于被胞外快速...     

β-淀粉样肽诱导小胶质细胞培养上清致海马神经元损伤模型的建立

目的：建立β淀粉样肽（Aβ1-40）诱导激活小胶质细胞的上清致海马神经元损伤的细胞模型,并初步研究神经元损伤的机制。方法：用不同浓度的可溶性Aβ1-40诱导激活小胶质细胞,光镜下观察不同时间点的细胞形态,ELISA检测其分泌的肿瘤坏死因子仪;用激活后的小胶质细胞条件培养基刺激海马神经元,光镜下观察细胞形态,Western blot检测刺激后海马神经元内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和硝基酪氨酸（NT）的表达水平,ELISA检测海马神经元内胱冬蛋白酶-3（caspase-3）活性来评价神经元的损伤程度。结果：终浓度为10μmol／L的Aβ1-40与小胶质细胞孵育24h后,取上清液加到培养的海马神经元,孵育24-72h,海马神经元较对照组形态有明显变化;经Western blot检测,神经元内iNOS、NT表达明显增加;ELISA检测神经元内caspase-3活性明显增高。结论：小胶质细胞被Aβ1-40激活后,其释放物有明显的致神经元损伤效应,表明建立了神经元损伤模型。     

积雪草对早期糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达及相关下游信号的影响

目的：通过研究积雪草（CA）对早期糖尿病肾病大鼠转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达及相关下游信号的影响,阐明积雪草防治早期糖尿病肾病（DN）的分子机制。方法：60只雄性SD大鼠,按体重随机分为假手术组（n=10）和造模组（n=50）。造模组大鼠进行右肾切除术,1周后给以腹腔注射链脲佐菌素（STZ）30 mg/kg,连续给3 d;72 h后测血糖,以 ≥ 16.7 mmol/L,尿糖+++以上及尿量大于对照组的50%为DN模型成模标准。假手术组进行右肾被膜损伤,并注射相应量生理盐水。造模组通过灌胃给药,分为：DN模型组（模型组）、DN+福辛普利组（蒙组1.6 mg/kg·d）、DN+积雪草高剂量组（高剂量组16.8 mg/kg·d）、DN+积雪草中剂量组（中剂量组11.2 mg/kg·d）和DN+积雪草低剂量组（低剂量组5.6 mg/kg·d）（n=10）,连续给药16周,每日上午1次灌胃。利用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾组织中TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3、p-Smad2/3及Smad7 mRNA和蛋白的表达。结果：与假手术组相比,DN组TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3 mRNA和蛋白表达及Smad2/3蛋白的磷酸化水平显著增加（P<0.05）、Smad7 mRNA和蛋白表达明显减少（P<0.05）,而福辛普利和高剂量积雪草能倒转DN引起的TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3 mRNA和蛋白表达增加（P<0.05）及Smad7 mRNA和蛋白表达降低（P<0.05）。结论：积雪草可能通过调控TGF-β₁/Smad信号通路起到防治DN的作用。     

贝母提取物对异丙肾上腺素致小鼠心肌纤维化的作用

目的：观察贝母提取物（FE）对异丙肾上腺素（Iso）致小鼠心肌纤维化的作用。方法：昆明种小鼠40只,雌雄兼用,随机分为4组（n=10）：对照组、模型组、FE 900 mg/kg、300 mg/kg剂量组,每只i.h Iso1.5 mg/kg （0.3 ml/d）造模,持续14 d;高、低给药组造模同时分别0.9 ml/d,0.4 ml/d灌胃FE,对照组s.c.等量生理盐水,连续30 d。实验结束,测定小鼠心重指数,血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量,HE和Masson染色分析心肌组织病理改变,免疫组化法检测心肌转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达。结果：与对照组相比,模型组SOD活性显著性下降,MDA含量显著升高（P<0.05）;显微镜下,心肌组织间隙变大,炎性细胞浸润,出血坏死细胞增加,TGF-β₁表达明显增加（P<0.05）;与模型组比较,FE组小鼠心重指数明显下降,SOD活性显著提高,MDA含量明显下降（P<0.05）,心肌组织病理学改变缓解,TGF-β₁表达明显下调（P<0.05）,且呈一定剂量依赖性。结论：FE治疗对抗Iso诱导心肌纤维化,其机制可能与清除氧自由基,减轻脂质过氧化损伤及抑制TGF-β1表达有关。     

异位（过）表达PGRN抑制IL-1β引起的髓核细胞损伤

炎症因子IL-1β是引起髓核细胞功能异常的关键因素之一。颗粒体蛋白原（progranulin,PGRN）是一种多功能生长因子,在组织修复、炎症反应等过程中发挥重要作用,但其在髓核细胞中的作用尚不清楚。本研究以IL-1β诱导的髓核细胞炎性损伤模型为研究对象,探讨PGRN对IL 1β诱导的髓核细胞损伤的保护作用及其机制。基因转染结合MTT方法证明,与IL-1β处理的细胞比较,过表达PGRN可逆转IL-1β引起的原代培养的髓核细胞生长抑制,促进细胞增殖。TUNEL技术和流式细胞分析显示,PGRN抑制IL-1β诱导的髓核细胞凋亡。Western印迹和RT-qPCR方法揭示,与IL-1β处理的细胞相比,过表达PGRN显著上调聚蛋白聚糖（aggrecan）和II型胶原（collagen type II）的蛋白质表达,但下调基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、分解素-金属蛋白酶ADAMTS-5的表达,同时抑制IL-1β诱导的炎性因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达,说明PGRN可缓解IL-1β引起的炎性反应,并减少细胞外基质（ECM）相关蛋白质的降解。此外,过表达PGRN还可降低p65、p-IkB a和β-catenin的蛋白质表达水平,提示PGRN可抑制IL-1β下游TNF-α介导的NF-κB信号途径及β-catenin途径。总之,上述结果提示,过表达PGRN可通过抑制IL-1β诱导的炎性反应、髓核细胞凋亡及基质代谢紊乱,缓解IL-1β诱导的髓核细胞损伤;PGRN的这种抗炎、抗基质降解作用可能与PGRN参与调控NF-κB和β-catenin信号途径有关。     

β淀粉样蛋白1-42对BV-2细胞产生一氧化氮功能的刺激作用

目的应用β淀粉样蛋白1-42(β-Amyloid,Aβ1-42)作用于小胶质细胞(microglia,MG),对MG产生一氧化氮(nitric oxide,NO)的作用进行研究.方法应用高度纯化的BV-2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型,测定加入Aβ1-42后细胞上清NO含量及细胞iNOS酶活力;Western blot法测定Aβ对BV-2细胞iNOS蛋白表达的影响,免疫细胞化学方法对iNOS蛋白的表达情况进行观察.结果 Aβ1-42可以刺激BV-2细胞产生NO、提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达,以上作用均具有时间及浓度依赖性.结论 Aβ1-42在体外可通过提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达而增加NO的分泌,为NO发挥神经元毒性作用创造了条件.     

阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白的生成及清除的调节

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种慢性退行性神经系统疾病,临床主要表现为进行性认知能力下降、记忆力衰退、人格改变等。AD的标志性病理特征包括脑细胞外β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积形成老年斑、细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)、神经炎症增加以及神经元凋亡。β淀粉样蛋白主要在神经元产生,是淀粉样前体蛋白经过一系列酶解反应生成的由39～42个氨基酸组成的多肽,调节Aβ的生成和清除能够有效延缓甚至逆转阿尔茨海默病的进程,因而具有重大的研究价值。β-分泌酶（β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1）为Aβ产生过程中的关键酶,其含量及活性的改变均能影响Aβ产生,在阿尔茨海默病的发生发展中发挥至关重要的作用;老年斑周围炎性细胞的聚集提示,AD与神经炎症高度相关,神经炎症相关细胞能够参与Aβ的清除,多种炎性因子也能调节Aβ的生成;非编码RNA虽很少直接参与Aβ的产生、沉积和清除,但其可以通过多种途径调节Aβ的产生。本文从β淀粉样蛋白生成及清除的机制着手,重点阐述了BACE1、神经炎症、非编码RNA对Aβ调控的重要作用,以期为AD发病机制的进一步研究提供思路,并对阿尔茨海默病早期干预及治疗提供理论参考。     

谷氧还蛋白rbGrx可延缓CL4176秀丽隐杆线虫中β淀粉样蛋白诱导的毒性

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与衰老相关的神经退行性疾病,其中β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）诱导的细胞毒性被认为是其发病的主要原因。本文以Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176为模型,研究了重组荞麦谷氧还蛋白（recombinant buckwheat glutaredoxin, rbGrx）对Aβ诱导的毒性和氧化应激的影响。结果显示,4 μmol/L rbGrx可以延长CL4176线虫平均寿命达20%左右,并增加衰老虫体运动能力约43.6%,延迟产卵高峰期1 d,同时可以有效延缓Aβ毒性诱导的瘫痪表型。进一步研究发现,在正常条件和Aβ诱导毒性时,rbGrx均能降低CL4176线虫体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,并上调SOD活性和GSH含量。另外,rbGrx下调Aβ mRNA水平44.1％,减少Aβ沉积量,并且明显上调热激因子1 hsf-1（2.01倍）和hsp-16.2（2.65倍）mRNA表达水平。这表明,rbGrx通过降低CL4176线虫体内的ROS水平和上调热激蛋白质的转录表达水平,降低CL4176秀丽隐杆线虫中Aβ诱导的毒性。结果提示,rbGrx可能具有预防AD的潜力。     

β-酪啡肽-7保护链脲佐菌素引起的大鼠肾损伤

研究β-酪啡肽-7（β-casomorphin-7,β-CM-7）对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾损伤的保护作用.结果显示：（1）β-酪啡肽-7降低糖尿病大鼠的采食量、饮水量和空腹血糖值,提高糖尿病大鼠的体重,但是差异不显著（P>0.05）.（2）β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠尿糖、尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮、肾脏指数和血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;Masson染色结果显示,β-酪啡肽-7治疗显著降低糖尿病大鼠肾脏的纤维化程度.（3）RT-RCR结果显示,β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白基因的表达.Western印迹显示,β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠肾脏Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达.上述结果表明,β-酪啡肽-7能够减缓糖尿病大鼠肾脏功能和肾脏纤维化程度,其机制可能与降低TGF-β1含量、减少胶原蛋白在肾脏的沉积有关.     

硫化氢对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响及其机制

目的：观察硫化氢（H₂S）对糖尿病大鼠肾脏组织纤维化的影响并探讨其作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常对照（NC）组、糖尿病对照（DC）组、糖尿病+硫氢化钠（DM+NaHS）组和糖尿病+炔丙基甘氨酸（DM+PAG）组,每组8只。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备1型糖尿病大鼠模型。造模成功4周后,DM+NaHS组和DM+PAG组大鼠每天分别腹腔注射56 μmol/kg NaHS和40 mg/kg PAG溶液。处理4周后,测定各组大鼠空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）和肌酐（SCr）水平;Masson染色观察肾脏组织胶原纤维变化,计算胶原容积分数（CVF）;透射电镜观察肾脏超微结构;利用试剂盒检测肾组织白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和羟脯氨酸（Hyp）水平;Western blot测肾组织TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）和IV型胶原（col-IV）的蛋白表达水平。结果：与NC组比较,DC组FBG、BUN、SCr、CVF、IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp均明显增高,肾脏胶原纤维沉积、超微结构损伤明显加重,TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV表达均明显增加。与DC组比较,除FBG外,DM+NaHS组中上述指标均明显改善;而DM+PAG组中上述指标损伤均进一步加重。结论：H₂S可以减轻糖尿病大鼠肾脏纤维化,其机制可能与减少促炎因子释放,下调TGF-β1/Smad3通路,抑制肾脏col-IV过量生成相关。     

奥曲肽对TGF-β1诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的：探讨奥曲肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖及凋亡的作用,并了解上述作用是否通过含有SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）介导。方法：体外培养大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）,以TGF-β1、奥曲肽、SHP-1抑制剂NSC87877作为工具药。将ASMCs分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+奥曲肽组、TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定ASMCs增殖,Western blot检测磷酸化SHP-1的水平。另将ASMCs分为对照组、0.01 nmol/ml奥曲肽组、0.1 nmol/ml奥曲肽组,Annexin V/P I双标记流式细胞仪分析方法检测细胞凋亡。结果：①TGF-β1组ASMCs的增殖反应高于对照组（P<0.01）,TGF-β1+奥曲肽组ASMCs增殖反应显著低于TGF-β1组（P<0.05）,TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组的增殖反应显著低于TGF-β1+奥曲肽组（P<0.01）;②0.01 nmol/ml奥曲肽组凋亡率显著高于对照组（P<0.01）,0.1 nmol/ml奥曲肽组与对照组比较凋亡率无显著差异;③TGF-β1组较对照组p-SHP-1水平显著降低（P<0.05）,TGF-β1+奥曲肽组较TGF-β1组p-SHP-1水平稍升高,但差异无统计学意义,TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组p-SHP-1水平较其余3组显著降低（P<0.01）。结论：奥曲肽可抑制TGF-β1诱导的ASMCs增生;低剂量奥曲肽促进ASMCs凋亡,较高剂量奥曲肽对ASMCs凋亡无明显影响;奥曲肽抑制ASMCs增生与SHP-1激活无关,可能通过介导生长抑素受体2（SSTR2）作用的其他机制或通过其他生长抑素受体（SSTRs）抑制ASMCs生长。     

Expression and changes of endogenous insulin-like growth factor-1 in neurons and glia in the gerbil hippocampus and dentate gyrus after ischemic insult

In the present study, we focused upon expression and changes of endogenous insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in the hippocampus of the Mongolian gerbil after ischemic insult. In sham-operated animals, IGF-1 immunoreactivity was absent from the hippocampus. IGF-1-immunoreactive (IR) neurons were detected at 12 h and 1 day after ischemic insult. In the hippocampal CA1 area, the IGF-IR neurons were non-pyramidal cells (GABAergic neurons). In the hippocampal CA2/3 areas, the IGF-1-IR neurons were pyramidal and non-pyramidal cells, and in the dentate gyrus the IGF-1-IR neurons were hilar neurons. Four days after ischemia-reperfusion, IGF-1 immunoreactivity disappeared from neurons, and significantly increased in astrocytes and microglia. These results suggest that the induction of IGF-1 in the CA1 area during the early stage (12-24 h after ischemic insult) is associated with the relative vulnerabilities of pyramidal glutamatergic neurons and non-pyramidal GABAergic neurons. The later increase (4 days after ischemic insult) of IGF-1 expression and protein content was found to promote the activities of astrocytes and microglia. These increases of IGF-1 in astrocytes and in microglia are associated with mechanisms that compensate for the effects of delayed neuronal death.     

稳定表达人源GABAAR-CHO细胞株的建立

目的: 构建α₁亚基诱导表达、β₂和γ_2L亚基稳定表达的人源α₁β₂γ_2L-GABA_AR-CHO(Chinese hamster ovary)细胞株。方法: 从人cDNA文库中扩增α₁、β₂、γ_2L亚基编码基因,分别构建亚基表达载体;将三个亚基表达载体共转染CHO-K1细胞,通过抗性筛选、膜电位检测法进行稳定表达克隆筛选;通过qPCR、Western blot对亚基表达进行鉴定;以激动剂GABA、阳性变构调节剂地西泮(diazepam,Dia)、拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculine)为工具药,采用全细胞膜片钳方法及膜电位检测法对稳定表达细胞的药理学功能进行鉴定。结果: 经克隆筛选获得表达量较高的α₁β₂γ_2L-GABA_AR-CHO并对其亚基表达鉴定,结果显示该细胞稳定表达α₁、β₂、γ_2L亚基,构建的α₁β₂γ_2L-GABA_AR-CHO细胞仅在加入四环素(tetracyclin)诱导的情况下表达α₁亚基并与β₂、γ_2L组装成具有功能活性的α₁β₂γ_2L-GABA_AR;对其进行全细胞膜片钳检测研究发现,GABA可对其产生激动效应,引起α₁β₂γ_2L-GABA_AR-CHO细胞产生氯离子通道特征性电流变化,Dia可剂量依赖性地增强GABA对α₁β₂γ_2L-GABA_AR的激动效应;在膜电位检测研究中,获得GABA激动效应EC₅₀为(177.72 ± 15.92)nmol/L,Dia变构效应EC₅₀为(3.63±0.52)μmol/L,拮抗剂Bicuculine拮抗效应IC₅₀为(538.83±29.55)nmol/L。结论: 通过采用诱导表达策略,成功构建了α₁β₂γ_2L-GABA_AR-CHO稳定表达细胞株,该细胞株具有对激动剂、阳性变构剂、拮抗剂特异性检测的药理学功能。     

Regulation of the CYP27B1 5'-flanking region by transforming growth factor-beta in ROS 17/2.8 osteoblast-like cells

The biologically active form of vitamin D, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ (1,25(OH)₂D₃), regulates osteoblast proliferation and differentiation. Production of 1,25(OH)₂D₃ is catalysed by the enzyme 25-hydroxyvitamin D₃-1-hydroxylase (CYP27B1). Though highly expressed in the kidney, the CYP27B1 gene is also expressed in non-renal tissues including bone. It is hypothesised that local production of 1,25(OH)₂D₃ by osteoblasts plays an autocrine or paracrine role. The aim of this study was to investigate what factors regulate expression of the CYP27B1 gene in osteoblast cells. ROS 17/2.8 osteoblast cells were transiently transfected with plasmid constructs containing the 5′-flanking sequence of the human CYP27B1 gene fused to a luciferase reporter gene. Cells were treated with either parathyroid hormone (PTH), 1,25(OH)₂D₃, transforming growth factor-beta (TGF-β) or insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and luciferase activity was measured 24 h later. The results showed that 1,25(OH)₂D₃ did not alter expression of the reporter construct, however treatment with PTH, IGF-1 and TGF-β decreased expression by 18, 53 and 58% respectively. The repressive action of TGF-β was isolated to the region between −531 and −305 bp. These data suggest that expression of the 5′-flanking region for the CYP27B1 gene in osteoblast cells may be regulated differently to that previously described in kidney cells.