转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响

研究了质粒DNA大小、质粒DNA浓度、CaCl2 浓度、热休克时间及感受态细胞保藏时间等因素对大肠杆菌HB1 0 1和JM1 0 5转化频率的影响 ,并对转化子中质粒DNA进行了分离、酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明 ,CaCl2 浓度、质粒大小和浓度 ,以及感受态细胞的活力对转化频率有重要影响 ,42℃热休克处理可以提高转化频率。     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2 浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响     

大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素

探讨了大肠杆菌菌株、细菌生长状态、转化溶液、抗冻剂及保存时间、质粒长度和纯度对感受态细胞转化能力的影响。结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A600为0.55的TG1制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高,可达2×106-4×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加和纯度降低,转化率有所下降。若感受态细胞要保存备用,以15％甘油为抗冻剂优于7％DMSO,但添加抗冻剂对转化率有抑制作用。贮于甘油的感受态细胞在-70℃冻存两个月后仍有较理想的转化率。     

一种优化的质粒转化简便方法

目的:质粒DNA转化时,比较不同的冰浴时间、热休克时间、预培养时间对转化效率的影响.优化质粒DNA转化方法,缩短了转化时间,该方法可获得与常规转化方法相当的转化效率.方法:质粒DNA加入感受态细胞中,混匀冰浴5min,42 ℃热休克60s,接着冰浴1min,37℃预培养10min,涂布预热至37℃的平板.结果:操作时间由2h减至20min,转化效率没受影响.结论:该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴３～10 min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2 h减至3～10 min.同时探讨了Ca²⁺浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响.     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

细菌自然转化的分子机制研究进展

自然环境中,具备自然转化能力的细菌可以自发地从外界获取DNA,从而获得新的遗传性状。为能够自然地被转化,细菌需首先建立一个被称作感受态的生理状态并在此状态下表达DNA摄取和加工相关的基因。DNA摄取基因的表达产物可组装一个能将外源DNA摄入细胞质的蛋白复合物。在细胞质中,进入的DNA可同基因组DNA发生同源重组或建立成一个独立的质粒。一般DNA摄入细胞的过程可分为两个阶段,即从外部基质到细胞周质和跨细胞内膜的转运。近年来,包括作者在内的研究人员发现大肠杆菌中存在新的自然质粒转化模式。本文将首先综述近年来细菌自然转化的分子机制,随后简要介绍大肠杆菌中独特的自然质粒转化模式。     

平末端DNA随机连接构建重组质粒

目的:拼接DNA片段并克隆。方法:用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果:通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论:该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。     

质粒pBR322电注入E.coli HB101的研究

常用的转化方法是用CaCl_2或CaCl_2/RbCl_2处理受体菌使成感受态。转化率约为10~3—10~6个转化子/μg质粒DNA。近年发展起来的电转化技术可使转化率提高到lC~(?)—10~(10)个转化子/μg质粒DNA。我们以质粒pBR322和大肠杆菌HB101为实验材料,对常用的转化方法和电转化的结果进行了比较,对电转化中获得最佳转化效果和各种参数如电压、脉冲时间、脉冲次数、循环数等进行了探讨。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。