生物技术在植物病害诊断中的应用

1 免疫技术 1.1 酶联免疫法 Voller[1]和Clark[2]等早在70年代中期就将现代血清学技术——酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)应用于植物病毒的检测.ELISA与血清学技术相比具有明显的优越性,可灵敏地大规模定量检测植物提取液中病毒蛋白的含量,这一技术现已成为植物病毒病害诊断的标准方法[3].以后,人们对ELISA技术在检测速度、表确性以及仪器装备等方面进行了改进,使之更加趋于完善.除此之外,其它一些以抗体为基础的检测技术如放射免疫检测、免疫荧光技术、免疫显微镜检技术等也用于植物病害的诊断.     

改良Trizol法提取血浆游离RNA

[目的]建立一种成本低、得率高的血浆游离RNA的提取方法。[方法]分别采用传统Trizol法、改良Trizol法、试剂盒法提取200μL健康成年人血浆中游离RNA,并比较三种方法所得RNA的浓度、纯度及大小片段RNA得率的差异。[结果]改良Trizol法所得RNA浓度是常规Trizol法的21. 7倍(P 0. 01),是试剂盒法的6. 4倍(P 0. 01);三种方法所得RNA纯度(A_(260)/A_(280))无显著差异;采用RT-q PCR方法检测血浆游离RNA大小片段的回收率,外参秀丽线虫miR-39-3p(cel-miR-39-3p)代表小片段RNA,GAPDH代表大片段RNA,改良Trizol法检测Cq平均值分别为15. 64和33. 34,平均低于常规Trizol法2. 05～3. 62个Cq,低于试剂盒法0. 32～3. 34个Cq。[结论]改良Trizol法提取血浆游离RNA相较于常规Trizol法提高了10～20倍,增加了得率。     

提高骨组织免疫组织化学方法质量的若干问题探讨

免疫组织化学方法 (Immunohistochemistrystaining,IHCS)技术是用已知标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体定性、定位或定量检测 ,经组织化学反应 ,使标记于特异性抗体的酶、金属及荧光素等呈现出某种颜色 ,并借助于光镜 ,荧光显微镜及电子显微镜等观察其颜色变化 ,从而了解抗原抗体结合部位和数量的一门新兴检测技术 [1～ 2 ]。它具有敏感性高、特异性强、方法步骤统一等特点 ,能将形态、代谢和机能密切结合在一起 ,已广泛应用于临床病理诊断、鉴别诊断和相关学科的研究之中。近年来 ,我们针对骨及其 IHCS技术的特点 ,对如何…     

不同参数对蛋白免疫印迹法结果的影响

[目的]探讨曝光时间、洗脱时间等参数对蛋白免疫印迹法结果的影响。[方法]通过测量灰度值,比较不同曝光时间(6 s和21 s)、洗脱时间(30 min和8 h)以及图像处理软件(Image J和Imagequant TL)对蛋白免疫印迹法结果的影响。[结果]上样量比值为2∶1的蛋白曝光6 s的灰度值读数分别为14766±724和7171±577(n=3),均数比值为2. 1∶1。延长曝光至21 s后相同样品灰度值分别为14932±1198和11994±616(n=3),均数比值减小为1. 2∶1;洗脱30 min和8 h后的曝光结果相比,上样量为1. 64μg蛋白灰度值分别为23713±1895和22892±571(n=3),差异无统计学意义; Image J和Imagequant TL两种软件对倍比梯度上样的蛋白样品读值,比值分别为1∶0. 56∶0. 41∶0. 22和1∶0. 59∶0. 40∶0. 15;对两组读值进行直线回归分析,可得斜率分别为0. 13和0. 14,提示两组读值趋势一致。[结论]曝光时间对蛋白免疫印迹法结果有明显影响,高丰度蛋白需要低曝光时间,才能保持确切的倍比关系;洗脱时间超过30 min对蛋白免疫印迹法灰度值结果没有直接影响;不同图像处理软件对灰度值结果分析趋势一致。     

EV71病毒核酸快速检测方法的比较

PCR方法检测肠道病毒71型(EV71)的分子诊断技术十分快速敏感。目前已有多篇文献报道了不同的检测EV71的PCR方法,但对不同方法检测结果的比较还少有报道。本研究将检测肠道病毒通用5’UTR基因的3种定量PCR(rRT-PCR)方法和1种普通PCR(cRT-PCR)方法和特异性检测EV71的2种rRT-PCR和1种cRT-PCR方法进行特异性和敏感性比较评估。所有试验方法都有较好的特异性,无交叉反应。核酸最低检测限值为从8.19×101～8.19×105个拷贝,rRT-PCR比cRT-PCR更敏感。所有的rRT-PCR方法检测50份临床标本时都较敏感。     

多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备

[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。     

黄连素对小鼠S-180移植瘤的抑制作用

[目的]利用S-180荷瘤小鼠及细胞研究黄连素抑制肿瘤的作用及分子机制。[方法]利用免疫组织化学染色、WST1实验、流式细胞术及Real-time PCR等技术,检测黄连素抑制S-180肉瘤细胞的作用及机制。[结果]体内实验结果表明黄连素组生存时间明显延长(P 0. 05),抑瘤率为25. 19%,肿瘤直径(2. 11±0. 39)显著小于对照组(2. 48±0. 20),磷酸化组蛋白H3及Cyclin D1阳性细胞数目明显降低(P 0. 05)。体外实验结果表明黄连素可以抑制S-180细胞的生长,并诱导凋亡(P 0. 05),Real-time PCR结果表明,黄连素组C-myc、Cyclin D1、Bcl-2及FAS表达水平降低,Caspase-1及PGC-1α表达水平升高(P 0. 05)。[结论]黄连素在体内水平抑制S-180荷瘤小鼠肿瘤的增殖,延长生存时间,在体外水平抑制S-180细胞的生长并诱导凋亡,黄连素通过调控增殖、凋亡及代谢等相关基因发挥抗肿瘤作用。     

抗ANXA1自身抗体ELISA检测方法的建立及应用

[目的]建立检测抗膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)自身抗体的ELISA方法,初步探索其临床应用。[方法]设计ANXA1特异性抗原肽并人工合成,用抗原肽制备可检测ANXA1抗体的ELISA板,通过回归方程的建立、精密度的测定和抗干扰能力的验证,建立检测ANXA1抗体的ELISA方法。用该法检测临床乳腺癌及健康对照患者血清中的抗ANXA1自身抗体。[结果]该方法在抗体浓度0.025～0.400μg/mL范围内线性良好,R²=0.994,连续5次批内和批间变异系数%均小于10%,对乳糜标本和溶血标本的检测相对误差均小于10%,用于乳腺癌患者抗ANXA1自身抗体的诊断上,实验组抗ANXA1自身抗体表达显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]建立了抗ANXA1自身抗体检测的ELISA方法,线性范围0.025～0.400μg/mL,变异系数小于10%,对乳糜标本和溶血标本检测的相对误差小于10%,应用于临床初步显示乳腺癌患者血清中抗ANXA1自身抗体高表达。     

抗原修复技术在免疫组织化学中的作用

免疫组织化学是一门免疫学与病理形态学相结合的新兴学科 ,是现代生物医学的一项重要方法学 ,具有操作简单、敏感性高、特异性强等特点 ,已经广泛应用于临床病理及其相关学科的研究之中 [1,2 ] 。目前采用甲醛为常规标本固定剂 ,醛基与组织蛋白质中的氨基形成交联使抗原决定簇被遮蔽 ,从而影响免疫组织化学结果 ,而且这种作用随着固定时间增长而加重 [3 ]。抗原修复技术的出现 ,使得原来许多只能在冰冻切片作免疫组织化学得以在石蜡切片上实现 ,抗原修复技术在免疫组织化学中的作用愈加明显 ,并且对免疫组织化学方法的敏感性起着决定性作用[…     

ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

IL-1β对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质、海马内蛋白激酶A表达的影响

目的　探讨白细胞介素 1β (Interleukin 1beta ,IL 1β)对谷氨酸钠致痫大鼠脑内PKACβ表达的影响 ,为阐明IL 1β在致痫中的作用机制提供资料。方法　随机将健康成年SD大鼠分为对照组、Glu组、IL 1β +Glu组、IL 1ra +IL 1β +Glu组和MCCG (2 methyl 2 carboxycyclopropylglycine +IL 1β+Glu组 (每组 8只 )。采用行为学测试及WesternBlot和免疫组织化学方法观察。结果　MCCG组大鼠痫性发作潜伏期 [平均 (1 1± 0 2min) ]较Glu组 [平均 (2 0± 0 3min) ]及IL 1β +Glu组 [平均 (1 8± 0 2min) ]明显缩短 (P 0 0 5 ) ,痫性发作持续时间 [平均 (4 6 4± 1 6min) ]明显延长(P 0 0 5 ) ,且发作程度加重 ,对照组及IL 1ra +IL 1β +Glu组无痫性发作 ;WesternBlot结果显示PKACβ含量在Glu组和IL 1β +Glu组大鼠大脑皮质及海马内均较对照组和IL 1ra +IL 1β +Glu组明显增多 (P 0 0 5 ) ,而对照组和IL 1ra +IL 1β+Glu组两组间无明显差别 ,MCCG +IL 1β +Glu组PKACβ含量显著高于其余各组 (P 0 0 5 ) ;免疫组化染色显示 ,PKACβ免疫反应增强主要表现在大脑皮质、海马CA3区及齿状回的颗粒细胞层 ,其各组间的变化与WesternBlot结果一致。结论　IL 1β参与致痫 ,IL 1对Glu致痫的促进作用与PKA介导的     

凝胶中痕量蛋白质和核酸的银染色法

高灵敏度的蛋白质银染色法最初是由Switzer和Merril于1979年建立的,其后Oakley、入江伸吉等人加以改良和简化,使检测的灵敏度提高到ng水平,可与放射自显影媲美。后来Somerville和Wang将该法扩大应用于聚丙烯酰胺凝胶中DNA和RNA的染色,山崎健一等又将该法推广到琼脂糖凝胶中DNA和RNA的染色。银染色法的突出优点是灵敏度高,用于蛋白质染色,比考马斯亮蓝染色感敏约50—100倍;用于RNA染色,比亚甲蓝染色敏感100—1000倍;用于DNA染色,比溴化乙锭染色敏感10—20倍。现将该法的要点和笔者的经验介绍如下。     

人肝细胞癌及其配对非癌肝组织、正常肝组织中热休克蛋白Hsp90基因mRNA水平的分析

 为定量分析和比较 2 2对人肝细胞癌 (HCC)及其配对非癌肝组织 (PNL)和 2例正常肝 (NL)组织中热休克蛋白Hsp(heatshockprotein) 90基因mRNA的表达水平 ,用狭缝杂交法检测hsp90 βmRNA的表达 ;并进一步用以特异性复合cRNA为内参照的定量RT PCR法对hsp90α和hspβmRNA的表达进行分析比较 .狭缝杂交结果显示 ,hsp90 βmRNA在 1 3例 ( 59 1 % )PNL中的表达平均升高至NL的 1 87倍 ;在 2 1例 ( 95 5% )HCC中的表达平均升高至NL的 3 45倍 ;在 2 0例 ( 90 9% )HCC中的表达平均升高至PNL的 2 75倍 .以cRNA为内参照的mRNA定量RT PCR结果显示 ,hsp90αmRNA在1 8例 ( 81 8% )PNL中的表达平均升高至NL的 3 0 6倍 ;在全部 2 2例HCC中的表达平均升高至至PNL的 2 0 8倍和NL的 5 1 0倍 .hsp90 βmRNA仅在小部分 ( 8例 ,36 4% )PNL中的表达轻度升高至NL的 1 2 7倍 ,而在全部 2 2例HCC中的表达显著升高至PNL的 2 95倍和NL的 2 52倍 .hsp90α和hsp90 β可能分别在人HCC发生、发展的不同阶段发挥不同的作用 ;以cRNA为内参照的定量RT PCR法是较狭缝杂交法更为灵敏、准确和快捷的mRNA定量分析方法 .     

猴免疫缺陷病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

目的以基因工程技术制备猴免疫缺陷病毒(SIV)的SIV30蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳方法(IC)用于特异性检测实验猴血清中抗SIV的抗体Ig G。方法应用原核表达载体p GEX-4T-1构建SIV SIV30基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为诊断抗原,建立免疫梳标准化检测程序,并应用于临床检测。结果最佳抗原包被量为0.02 mg/m L;制备好的IC均能够特异性检测到相应的SIV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,SIV30蛋白能够敏感地检测到1∶400倍稀释的SIV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,IC与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。结论原核表达了SIV30蛋白,制备了IC,并应用于临床检测。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

用改良消减杂交筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中高表达基因

 为了研究类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞 (fibroblast- like synovialcells,FLS)过度增殖和破坏软骨的分子机理 ,利用改良消减杂交法以骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)病人滑膜细胞为对照 ,筛选 RA滑膜细胞中的高表达基因 .将得到的基因片段克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,将阳性克隆进行核酸序列分析 ,最后用 Northern杂交方法检测一些高表达基因在 RA和 OA病人滑膜细胞中的表达水平 .结果显示 ,共分离到 1 50个 RA高表达基因片段 ,其中长于 1 0 0 0 bp的片段占 8% (1 2 /1 50 ) ,长于 40 0 bp的片段占 36.7% (55/1 50 ) ,在大于 40 0 bp的片段中 ,假阳性率为 2 3.7% (1 3/55) .在测序的 1 8个片段中 ,已知基因有 1 2个 ,其中包括 IGF- 1结合蛋白 (IGFBP)特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B等 .新序列有 6个 ,其中两个序列分别与 Ring- box蛋白 1和 SON DNA结合蛋白同源 .对 IGFBP特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B基因的 Northern杂交分析显示 ,在 RA病人滑膜细胞中 ,这些基因的表达水平高于 OA病人滑膜细胞 .这些结果提示 ,这种改良消减杂交法是一种简便有效的分离差异表达基因的方法 ;IGF- 1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶、层粘     

FGF13通过ROS介导抑制乳腺癌细胞MCF7凋亡

[目的]探究成纤维细胞生长因子13(Fibroblast growth factor 13,FGF13)对乳腺癌细胞MCF7凋亡的调控作用。[方法]Western Blotting和免疫组织化学染色检测FGF13的表达;构建干扰和超表达FGF13的MCF7细胞株;TUNEL法和Western Blotting检测细胞凋亡;DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。[结果]与正常乳腺细胞相比,FGF13在乳腺癌MCF7细胞中表达升高(0.16±0.01 vs 3.89±0.23,P<0.001)。干扰FGF13后,MCF7细胞凋亡率升高(2.20%±0.10%vs 10.79%±0.69%,P<0.001),促凋亡蛋白Bax(0.99±0.02 vs 2.56±0.02)、Caspase 3(1.00±0.01 vs 1.70±0.01)和p53(0.98±0.01 vs 2.22±0.03)的表达上调(P<0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-xl(0.99±0.01 vs 0.29±0.01)、Bcl-2(0....     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

本文旨在制备小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglo binbinding protein,mUGBP)多克隆抗体,为后续研究工作奠定基础。通过生物信息学分析方法预测mUGBP蛋白的跨膜结构、理化特性、疏水性等因素,设计出两段多肽,分别与匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)交联后免疫新西兰兔,结果显示其中一个含13个氨基酸残基的多肽序列(221st～233rd)可用作抗原免疫动物,并成功获得高效价的抗mUGBP多克隆抗体。通过ELISA法检测其效价为1:108,亲和层析纯化后Westernblot检测抗体特异性,并将制备的抗体应用于免疫印迹及人和小鼠肺组织免疫组织化学和免疫荧光检测,结果显示本研究制备的抗体具有特异性,且用该抗体成功在人和小鼠气道上皮细胞和肺血管内皮细胞检测到UGBP蛋白表达。结果表明,本研究通过生物信息学方法成功预测了抗原表位,并据此预测成功制备了高效价、高特异性的抗mUGBP多克隆抗体。     

心血管疾病相关的MicroRNA-21新型检测方法的建立

[目的]建立一种测定miR-21含量新型实验方法。[方法]利用microRNA-21(miR-21)作为靶标,并设计基于双链特异性核酸酶(Duplex specific nuclease,DSN)及杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)的探针MP、H1及H2,通过加入靶标从而引起DSN和HCR反应,达到双重信号放大的目的,最终信号输出方式为DNAzyme显色,裸眼可视,根据其产生颜色强度对靶标进行定量检测。[结果]DSN结合HCR靶标的最低检测限可达1 pmol/L,线性范围为1 pmol/L～1μmol/L,特异性良好,除靶标miR-21外,非特异性靶标均无明显信号产生,在人体血清实际样品中检测miR-21,其回收率可达到92. 3%～101. 5%。[结论]该检测方法成功建立测定miR-21含量的技术平台,灵敏性可达1 pmol/L,且特异性好、快速可视,为研究及临床诊断心血管疾病提供技术依托。     

压力负荷型心肌肥厚大鼠心肌组织相关基因的分离

心肌肥厚是心血管疾病常见的临床并发症 ,与冠心病、心衰、脑卒中等心血管疾病密切相关[1] ,其发生机制目前仍不清楚 .探讨其机制将为心肌肥厚及相关疾病的研究和治疗提供有益的线索 .本研究选用腹主动脉绑扎的左心室肥厚大鼠模型 ,运用差减杂交法 ,研究其中相关基因的表达变化 .1　材料和方法1 .1　压力负荷型左心室肥厚大鼠模型采用腹主动脉缩窄法[2 ] :雄性健康 Wistar大鼠 ( 2 0 0 g左右 )用速眠新 846合剂麻醉 ,将直径 0 .7mm的小圆棒以3/0丝线绕腹主动脉一起绑紧 ,抽出小圆棒 .对照组行假手术 .大鼠血压测量采用颈动脉插管 (术后 2 8…     

人肺炎链球菌快速检测胶体金试纸的研制

[目的]研制一种快速检测人肺炎链球菌(S. pneumoniae)的免疫胶体金层析试纸。[方法]对肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)基因序列(Gen Bank:U89711)作生物信息学分析,选取抗原表位强、种内同源性高的片段克隆表达纯化重组蛋白rPspA,并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;以双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸,并对其特异性、灵敏度以及稳定性进行验证分析。[结果]制备的胶体金试纸对rPspA最低检测限达到0. 1pg/m L,可在15min内完成对肺炎链球菌的检测,与其他10种重要呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃条件下保存6个月仍具有良好的重复性和稳定性。[结论]PspA蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Sp的检测标志物,以其抗体为基础制备的胶体金免疫层析试纸,适用于Sp菌感染的临床快速检测。