乙烯和1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因参与玫瑰花发育过程中细胞程序化死亡的调控

作为植物有性繁殖器官--花的花瓣通常生命周期短,其中有一个敏感的、严格控制的细胞程序化死亡过程.为了揭示细胞程序化死亡过程中发生的反应或者其组成成分,解释玫瑰花发育过程中的细胞程序化死亡过程的机理,测定了在整个花发育过程中玫瑰花瓣的乙烯释放速率、ACC合酶基因的转录产物(mRNA)、ACC合酶活性以及ACC含量.结果显示在花发育过程前期(阶段1、2)检测不到乙烯产生,在花瓣完全绽开时花瓣中乙烯开始产生.在花发育后期(阶段4、5)花的衰老与乙烯释放速率的升高同时发生.在花发育前期没有ACC合酶基因的转录产物积累,该基因在花瓣完全绽开时开始表达,在花发育后期逐渐增强.ACC合酶活性与ACC含量的变化趋势与乙烯的一致.在玫瑰花发育后期乙烯诱导和调控花瓣的细胞程序化死亡.ACC合酶基因、ACC合酶以及ACC都是玫瑰花瓣程序化死亡过程中的重要调控因子.     

乙烯生物合成途径及其相关基因工程的研究进展(综述)

在对植物激素乙烯生理功能作简要回顾的基础上着重对乙烯的生物合成途径中的关键酶,包括腺苷蛋氨酸合成酶、ACC合成酶及ACC氧化酶的性质和基因的研究进展作了综述,同时展现出了与调控内源乙烯生物合成有关的基因工程的整体轮廓。     

一种异常氨基酸——-1-氨基-环丙烷-1-羧酸的合成

<正> 1 氨基—环丙烷-1-羧酸(ACC)是一种存在于苹果、梨等果汁中的异常氨基酸,是一类新型的植物生长调节剂,广泛应用于植物生理、园艺和农牧业等方面,在实践上也有着重大的经济价值,因而有关ACC的应用文章日益增多。ACC的合成方法有4—5种,我们采用来源方便的丙二酸二乙酯作为基本原料,并对Engeld的方法作了重大改进,成功地合成了ACC。在环化步     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

控制番茄果实成熟的基因工程

乙烯是植物的一种催熟激素,其合成前体是蛋氨酸(Met),它通过三步反应形成乙烯: 乙烯通过分子克隆与异源系统表达,已鉴定了腺苷甲硫氨酸(AdoMet)合成酶[反应(1)],1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶[反应(2)]与ACC氧化酶[反应(3)]的编码基因。该途径的限制步骤是ACC合成酶催化的反应(2)。应用基因工程的方法已将ACC合成酶、Acc     

番茄1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合DNA序列的构建

根据番茄ACC合成酶基因（LE—ACC2）DNA序列,以番茄(LycopersiconesculentumMill)果实的总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到预期大小的该基因编码区内部分DNA序列,插入到质粒载体pGEM—3zf(＋)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间后转化E．coliDH—5α,可选出重组子pRE,经酶切,PCR及DNA序列分析证明克隆成功;将pRE上的目的DNA序列以反义方式构建到我室已合成并克隆的含核酶DNA序列的重组质粒pRⅠ的BamHⅠ和HindⅢ之间,构成含有反义RNA-核酶嵌合DNA序列的重组质粒pREⅠ,经酶切及序列分析,结果与预期一致.     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

水稻中乙烯生物合成关键酶OsACS和OsACO调控机制研究进展

乙烯在调控水稻(Oryzasativa)生长发育及胁迫响应中具有重要作用。乙烯生物合成的第1步是甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸(SAM),然后在ACC合酶(ACS)的催化下合成乙烯前体物质ACC,最后通过ACC氧化酶(ACO)生成乙烯。该文综述了水稻乙烯生物合成途径中2个关键酶OsACS和OsACO在转录及翻译后的调控机制,提出了一些未解决的问题,并展望了未来的研究方向,以期加深人们对乙烯生物合成复杂机制的理解。     

植物激素乙烯生物合成与乙烯感受的分子机理

乙烯是分子结构最简单的植物激素,其生物合成途径的最后两个酶是ACC合成酶和ACC氧化酶。这两个酶基因已从许多植物中克隆,两个酶均由多基因家族编码。通过对乙烯不敏感突变体和结构性三重反应突变体的遗传分析表明,乙烯感受以及信号传递途径是由ETR1、CTR1和EIN3等成分组成,最终导致乙烯调节基因的表达。     

番茄果实ACC合成酶的性质

测定了经4步纯化、比活性达20000U／mg蛋白质以上的番茄果实伤诱导ACC合成酶的一些酶学性质。酶反应最适PH值为9．5;酶在pH8．0下最稳定,pH7．5－10短时间处理不会使酶发生不可逆变性;酶在pH8．0和9．5的Km值分别为23和4Dμmol／L;根据酶反应不同时间的产物累积量,得出反应速度随时间的变化符合函数关系式Vt＝V0e－kt,并根据此式求出酶的半寿期为107min。光照对酶活性有抑制作用。酶的DTNB化学修饰结果表明,在酶活性中心的PLP结合部位很可能有半胱氨酸残基存在。     

β-半乳糖苷酶的研究进展

对β半乳糖苷酶的性质及作用机理作概述,同时对利用生物技术进行β半乳糖苷酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

嗜酸古菌Cuniculiplasma divulgatum来源的GH1家族中温β-葡萄糖苷酶CdBglA的原核表达及酶学性质分析

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。从NCBI数据库中获取了C. divulgatum来源的GH1葡萄糖苷酶氨基酸序列,然后制备重组质粒pET-30a(+)-CdBglA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,对纯化后的CdBglA进行酶学性质研究。结果发现,重组酶CdBglA的分子量为56.0 kDa,最适pH为5.5,最适温度为55℃。该酶具有良好的pH稳定性,在pH 5.5-11.0范围内处理1 h,仍维持92.33%以上的酶活力。以p NPG为底物时的酶促反应动力学参数Km、Vmax和Kcat/Km分别为0.81 mmol、291.99μmol/(mg·min)和387.50s-1mmol-1。其在终浓度5mmol/L重金属离子的影响下均能保持90.33%以上的酶活力;在15%的乙醇溶液中酶活力被提高了28.67%,在2...     

一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1菌株γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh 的克隆、表达及酶学性质

【目的】γ-丁基甜菜碱羟化酶是生物体内合成L-肉碱的关键酶。从假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1中克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为生物转化生产L-肉碱奠定基础。【方法】通过PCR克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET-15b;表达产物经His.Bind Resin纯化后对BBH进行酶学性质及三维空间结构分析;并以静止细胞进行L-肉碱的转化。【结果】成功地克隆了一个γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh(GenBank:JQ250036),并实现了其在E.coli中的高效表达。融合蛋白以同源二聚体的形式存在,单个亚基的分子量约46.5 kDa,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。该酶在45℃以下稳定。在pH6.0时该酶有最高的pH稳定性。以表达bbh基因的重组大肠杆菌静止细胞转化L-肉碱,L-肉碱产量可达12.7mmol/L。【结论】Pseudomonas sp.L-1γ-丁基甜菜碱羟化酶与现有报道的bbh基因有较大的差异。由该基因表达的γ-丁基甜菜碱羟化酶能有效地转化γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱。本研究不仅丰富了γ-丁基甜菜碱羟化酶基因资源,而且为L-肉碱的生物转化提供了一种新的转化方案。     

反义基因促进芥菜形态发生

新加坡大学利用编码1-氨基环丙烷-1-羧酸盐(ACC)氧化酶(一种催化ACC转化成乙烯的酶)的反义基因转化了芥菜植株。结果发现,与未转化的对照植株相比,转基因植株的乙烯生产量降低,离体培养物再生苗能力显著增加。高效再生性转基因植株始终保持ACC氧化酶活性和乙烯生产量降低。在R1代亦出现反义基因的效应。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究（英文）

【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD~+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, k_(cat)值为2.4±0.06/s~(–1),5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg~(2+)和Mn~(2+)可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。     

O2、ACC和CO2对番木瓜ACC氧化酶活性的影响

研究了番木瓜果皮l-氨基环丙烷-l-羧酸(ACC)氧化酶的部分纯化,底物(O2和ACC)浓度、辅助因子(CO2和Fe2+)和抑制剂(Co2+和α-氨基异丁酸)对体外乙烯产生速率的影响.通过DEAE-Sepharose和Phenyl-Sepharose柱层析后,番木瓜果皮ACC氧化酶被纯化了19.5倍.在乙烯产生中,ACC氧化酶对O2的Km值主要取决于ACC的浓度,随着ACC水平的增加而下降;当O2的浓度增加时,酶对ACC的Km值降低.CO2显著地增加酶的活性以及对O2和ACC的Km值.Fe2+提高酶的活性,Co2+抑制酶的活性;Fe2+能够拮抗Co2+对酶活性的抑制作用.这些动力学资料表明ACC氧化酶遵循一种顺序结合机制,首先与02结合,然后与ACC结合.     

分子信标方法研究HIV-1整合酶3'加工反应动力学

HIV-1整合酶催化病毒cDNA与宿主细胞基因组DNA的整合,是病毒在宿主细胞中增殖的一个关键酶.3'加工是整合酶催化整合过程的第一步反应,3'加工反应动力学的研究对整合酶催化机理研究和以整合酶为靶点的药物研发都具有重要意义.构建了野生型HIV-1整合酶重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过对包涵体变性、复性,纯化得到了整合酶蛋白.基于分子信标原理,设计了荧光和淬灭基团标记的DNA底物,通过荧光信号实时监测3'加工反应,对酶反应的动力学性质进行研究.结果表明,纯化的整合酶蛋白具有较高的活性,酶反应表现出显著的Mg2+偏好性.酶动力学研究(Km=131.79 nmol/L,Kcat=0.0042 min-1)表明,该分子信标方法和设计的DNA底物可用于整合酶3'加工反应动力学研究以及酶反应性质的研究.     

分子信标方法研究HIV-1整合酶3'加工反应动力学

HIV-1整合酶催化病毒cDNA与宿主细胞基因组DNA的整合,是病毒在宿主细胞中增殖的一个关键酶。 3'加工是整合酶催化整合过程的第一步反应,3'加工反应动力学的研究对整合酶催化机理研究和以整合酶为靶点的药物研发都具有重要意义。构建了野生型HIV-1整合酶重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过对包涵体变性、复性,纯化得到了整合酶蛋白。 基于分子信标原理,设计了荧光和淬灭基团标记的DNA底物,通过荧光信号实时监测3' 加工反应,对酶反应的动力学性质进行研究。 结果表明,纯化的整合酶蛋白具有较高的活性,酶反应表现出显著的Mg²⁺偏好性。 酶动力学研究 (K_m = 131.79 nmol/L,K_cat = 0.0042 min ^-1) 表明,该分子信标方法和设计的DNA底物可用于整合酶3'加工反应动力学研究以及酶反应性质的研究。