与TMV-RNA装配起始位点互补的cDNA片段对TMV体外装配的抑制

合成了与TMV-RNA病毒装配起始位点互补的、长度为二十个核苷酸的DNA片段。该片段用~(32)P标记后,代替反义RNA(antisense RNA)与TMV-RNA进行硝基纤维素膜点杂交和溶液杂交。结果表明,该cDNA片段在两种条件下均能与TMV-RNA进行杂交。将溶液杂交的RNA-cDNA复合体经酒精沉淀,再与TMV衣壳蛋白的20S聚合体制剂进行体外装配,用测定310nm吸收光谱变化和电子显微镜观察的方法鉴定装配结果。实验证明,该cDNA片段与TMV-RNA杂交后抑制了装配起始位点的活力,从而使TMV病毒颗粒的装配不能完成。这一结果提示,TMV基因装配起始位点顺宁的cDNA和反义RNA能够在体外抑制TMV病毒颗粒的装配。     

大麦条纹花叶病毒新疆株RNA5′-末端帽子结构的鉴定

在弱碱条件下一些RNA病毒蛋白外壳可以特异性地从RNA5＇-末端开始剥落,对大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA以含帽子结构的TMV-RNA和不含帽子结构的CpMV-RNA为正,负对照,在弱碱条件下剥壳,用合成的pCp特异性地标记RNA5＇-末端帽子结构上的3＇-羟基,经碱水解后纸电泳分离单核苷酸,见BSMV-XJ-RNA和TMV-RNA同样含有m~7G~*p,而CpMV-RNA则无,证实BSMV-XJ-RNA在5＇-末端具有m7G帽子结构,同时对BSMV的蛋白外壳在弱碱条件下剥落的时间,条件及标记方法进行了研究。     

放线菌素D对烟草花叶病毒RNA在离体烟叶中复制的影响

本文报道放线菌素D(AMD)在离体烟叶中对烟草花叶病毒(TMV)的增殖及其核酸(TMV-RNA)复制的影响。按每克叶片用40μgAMD处理,能抑制70％以上叶组织总RNA的合成,在此剂量下AMD对病毒增殖及其核酸复制的影响与用药的时间有密切关系。在接种病毒前5小时或于接种同时给药对病毒增殖和病毒RNA复制都有强烈的抑制作用,可抑制90％以上;而接种后8小时用药就不再表现抑制作用了;接种后24小时用药不但不表现抑制作用,相反对病毒增殖和TMV—RNA的复制都有一定的刺激作用。AMD对TMV增殖和对TMV-RNA复制的影响完全一致。     

rnc基因的高表达及核糖核酸酶Ⅲ的纯化

根据大肠杆菌中核糖核酸酶Ⅲ(RnaseⅢ)含量很低的原因是RnaseⅢ能作用于自身基因(rmc)转录物5’端、负反馈调控其自身合成,设计RnaseⅢ高表达的方案。去除rnc基因5’侧能转录生成可被RnaseⅢ降解的RNA结构的序列,保留整个rnc基因及其5’侧的天然翻译起始序列,将之置于λPL启动子控制下,所构建的质粒在大肠杆菌中经诱导后高表达出：RnaseⅢ,其含量达细胞总蛋白质量的65％以上,并在菌体内形成包涵体。利用RnaseⅢ溶解度变化的特点,在低温、低盐条件中裂菌,并洗涤沉淀,在室温、高盐条件下溶解、过Q－sepharose FF柱,获得具有良好活性、电泳纯的RnaseⅢ,收获量为10－12mg／100ml培养液。同时还发现RnaseⅢ具有特异性结合ATP的活性。     

小麦胚无细胞体系中TMV-RNA指导的氨基酸参入

在小麦“农大139”品种所制备的麦胚无细胞体系中,TMV-RNA、YMV-15~#-RNA以及poly(rA)都能高效地促进~(14)C-氨基酸的参入。对天然的mRNA,其最适镁离子浓度为2.5mM,最适钾离子浓度为70mM,TMV-RNA的最适量为15微克/0.2毫升。比较了六种不同~(14)C-氨基酸以及蛋白水解液的参入情况,其中以~(14)C-Leu为最高(130克分子/克分子TMV-RNA)。TMV-RNA在该体系中能指导~(14)C-His的参入值得注意,这可能是由TMVRNA的非外壳蛋白顺反子决定的。     

单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响

为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响。利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的Rnase Ⅲ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响。结构域分析结果显示,LM-Rnase Ⅲ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应。体外酶活实验表明,Rnase Ⅲ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS的降解活性有所降低(P0.001);第122位谷氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS降解活性极显著下降(P0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM Rnase Ⅲ RncS酶活性的关键位点。     

感染番茄花叶病毒及其弱毒系的烟叶中病毒双链RNA的比较

利用3H-尿嘧畦核苷标记技术、抗Rnase性质和聚丙烯酰胺凝肢电泳分析,比较了接种番茄花叶病毒(ToMV)及其弱毒系N14的烟叶中ds-RNA含量的变化。接种后第2天,N14的抗Rnase的ds-RNA为58．4％,ToMV为4．8％随着接种时间延长,ToMV的ds一RNA迅速降低到10.4—18．5％,而N14 的仍保持在25．5--36．6％,的较高水平。Ds一RNA的聚丙烯酰胺凝肢电泳分析证实了上述结果。讨论了ds-RNA在具有单链RNA为基因组的病毒毒力中的可能作用,ds-RNA含量高可能降低病毒合成能力和／或诱导某种类似干扰素的抗病毒物质的产生。     

细菌DNA的一种大量提取方法

本文介绍了一种大量提取细菌DNA的方法。该法是用60℃裂解菌体,以氯仿-苯酚去除蛋白,用Rnase去除RNA,用1倍体积95%乙醇沉淀DNA,省略了异丙醇沉淀步骤。而且该方法操作方便,对仪器要求不高。该法改进结果是:可稳定地得到50—60%的DNA回收率。可用于革兰氏阴性和阳性细菌的DNA提取。有些菌株用Marmur法和Zaslott法提取,DNA回收率在10%以下,采用本法仍能得到50%的回收率。每次提取的DNA量在毫克数量级。特别适合用于Tm法测定DNA G+C mol%含量所需DNA样品的制备。     

用Rnase Ⅲ制备的小干涉RNA降解SARS冠状病毒基因的细胞内转录物

SARS冠状病毒是引起重症急性呼吸综合症的主要原因,目前尚没有特效药物或疫苗对抗这种新病毒。RNA干涉是指双链RNA可以特异地降解细胞内同源基因的Mrna。在哺乳动物细胞中,<30bp的小双链RNA能引起RNA干涉,又可以避免干扰素反应。通过体外转录得到SARS病毒3种基因RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白及核衣壳蛋白部分片段的长双链RNA,然后用Rnase Ⅲ有限切割成长度<30bp的小干涉RNA。同时把上述3种基因片段分别连接到质粒Pgl3-Control中,得到的3个质粒Pgl-R、Pgl-S和Pgl-N可以分别在细胞内转录出荧光素酶RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白、核衣壳蛋白的杂合Mrna。上述质粒分别和相应的小干涉RNA共转染HEK293F细胞,测定荧光素酶活性,结果小干涉RNA使相应质粒表达荧光素酶的活性显著下降;用逆转录定量PCR反应测量Mrna丰度,结果表明上述小干涉RNA可以特异地降解相应的病毒基因转录物。     

RNA的催化功能和类病毒的自我切割

几年前人们还认为起催化作用的酶一定是蛋白质,细胞内起催化作用的分子和携带遗传信息的分子是分工的。近年来陆续发现一些RNA分子能起催化作用,改变了这一观念。由于RNA分子具有携带信息和催化作用双重功能,实验室的研究亦表明,在原始地球的条件下能产生ATP,锌离子等催化则可产生RNA片段,无酶存在下RNA能复制,但DNA原料在无     

嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究

从５８株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在９５℃中保温６０ｍｉｎ后仍保留原来活力的７５％．测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适ｐＨ、最适离子强度、最适温度,以及酶的热稳定性、米氏常数、活化能等等,还研究了一些无机离子、氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响．ＤＮＡ杂交方面的初步实验结果表明用该酶标记的核酸作为非放射性探针可用于在高温下进行的杂交反应．     

第十七讲 高等植物的离子运转(续)

六、细胞膜与离子运转细胞膜最基本的性质是它对物质透过的障碍,而且具有选择性,由于这些性质,它能控制什么物质透过它,透过多少。控制离子的运转对于生理过程的稳定非常重要,因为离子的运转直接影响到细胞的pH、细胞的渗透压和各种代谢功能;膜还参与在ATP的产生、光合作用的能量转换;这些过程也都和离子通过膜的运转有关。     

RNA病毒表达调控研究中的RNA结构分析技术

RNA病毒的多个生命过程如基因组复制、蛋白翻译等均需要特定RNA元件的调控,RNA结构是其发挥调控作用的分子基础,研究这些RNA元件结构及其在调控过程中的动态变化,将有助于深度解析相应过程的调控机制。RNA结构分析技术可以解析RNA元件的结构(二级结构和三级结构)。目前,RNA结构体分析技术主要有以下几种:Rnase酶法、In-line probing技术、SHAPE技术(Selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)、核磁共振技术、RNA结晶以及体内分析技术。本文将对RNA结构分析技术的发展历程、具体技术原理和操作细节、未来发展进行叙述,为相关科研工作提供技术参考。     

Oligo(dT)-纤维素与Oligo(U)-纤维素的合成及其应用

Oligo(dT)-纤维素与Oligo(U)-纤维素具有分离信使RNA(mRNA)的功能。这是由于大多数的mRNA 分子的3’-末端含有多聚腺嘌呤核苷酸的片段(亦有例外,如一类组蛋白的mRNA),在低温与高离子强度的条件下,此片段能与多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸或多聚尿嘧啶核苷酸形成互补的碱基配对,而核糖核蛋白体RNA(rRNA)与转移RNA(tRNA)缺少多聚腺嘌呤核苷酸的片段,不能被该树脂吸附,利用这一特性可将mRNA与其它RNA分离开来。     

依赖于DNA的RNA聚合酶研究 Ⅶ.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很多报道。但是以高等植物为材料研究RNA聚合酶远不如其他真核生物多,在植物细胞中RNA聚合酶B(或Ⅱ)的含量比RNA聚合酶A和C要丰富,而且性质也比较稳定,这对研究RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中     

一种高效经济的高质量植物RNA提取方法

建立了一种高效经济的植物RNA提取方法.在提取缓冲液中加入蔗糖、氯化钾和镁离子以提供对RNA分子的保护.破碎后的细胞于提取缓冲液中裂解后,用酚/氯仿变性并去除内源RNA酶和其他蛋白质,而后用pH 5.6 的NaAc沉淀RNA.用该方法提取RNA的得率较高,经电泳检测,RNA的完整性很好.RNA印迹分析和RT-PCR也都得到很好的结果.该方法还使实验成本大大降低.     

依赖于DNA的RNA聚合酶研究 VII.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很 多报道〔3,41。但是以高等植物为材料研究RNA 聚合酶远不如其他真核生物多，在植物细胞中 RNA聚合酶B（或11）的含量比RNA聚合酶A 和C要丰富，而且性质也比较稳定IS]，这对研究 RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中 的作用是很有利的。我们以玉米自交系黄早4 为材料，提取了RNA聚合酶B。本文将报道植 物RNA聚合酶B的分离和纯化，并研究这种酶 的性质和功能。     

GFP工程酵母菌的构建及其对Cu2+的荧光响应

从酿酒酵母基因组DNA中克隆到金属硫蛋白启动子(PCUP1)片段,将绿色荧光蛋白(GFP)基因置于PCUP1的调控下,构建重组质粒pCUP9K-GFP,并通过氯化锂法转化毕赤酵母,获得工程菌株。工程菌细胞及其发酵液中可检出GFP荧光,表明PCUP1能启动外源基因GFP转录,使工程菌表达并分泌GFP。研究发现,工程菌培养液中分别加入10μmol/L的铜、铬、镉和砷离子后,铜处理组GFP荧光强度明显增加,其余三种离子对工程菌荧光强度影响不大;用铜离子诱导后,工程菌发酵上清液的荧光强度明显增强,并与铜离子浓度(0～1mmol/L)呈正相关。研究表明,该工程菌中启动子PCUP1受铜离子诱导,GFP的表达对铜离子具有剂量依赖性,在一定浓度范围内,GFP荧光强度与铜离子浓度呈正相关。     

RNA促进小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性

同样的基因在不同的分化细胞中表达不同,基因的选择性表达问题涉及分化和衰老的本质。转录基因对DNaseⅠ(DNA酶Ⅰ)消化敏感,本文研究了RNA对小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性的影响。分离BALB/c小鼠脑细胞核,加入终浓度为2mol/L的NaCl破坏核小体结构,加入不同量、不同来源的RNA,装透析袋,逐渐降低离子强度进行染色质重组。重组染色质中加入DNaseⅠ消化DNA,PCR扩增白蛋白基因的外显子1到外显子2约1200bp区段,PAGE电泳后,用银染色观察不同来源RNA促进DNaseⅠ对白蛋白基因的消化作用。不同组织来源（肝、肺、肾、脑）RNA对小鼠重组染色质中白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性均有促进作用,其中肝和肺RNA促进消化作用较强;酵母tRNA无显著促进消化作用;消化促进作用与RNA剂量有关。RNA能增加DNaseⅠ对白蛋白基因的消化敏感性且有组织（细胞）来源特异性。又委托丹麦Chemical R D 实验室合成2条与白蛋白基因互补的各23核苷酸的RNA,用其进行重组试验。结果表明,重组混合物中含有低至0.2μg/mL的RNA,即可以发挥显著的DNase I消化促进作用。     

嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究

从５８株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在９５℃中保温６０ｍｉｎ后仍保留原来活力的７５％。测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适ＰＨ,最适离子强度,最适温度,以及酶的热稳定性,米氏常数,活化能等等,还研究了一些无机离子,氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响。