不同剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠模型的临床及生物学特征比较

本研究探讨不同剂量DPP4转导小鼠后对中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)感染建模及其生物特性的影响。首先将表达MERS-CoV受体DPP4的重组腺病毒以高剂量(2.5×108 PFU/只)、低剂量(0.5×108 PFU/只)分别转导转导BALB/c小鼠,继而滴鼻接种MERS-CoV,建立MERS-CoV感染小鼠模型。对成功构建的小鼠感染模型分别进行体征、病毒复制、免疫病理及抗体应答的比较分析。结果表明:两种剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠,均可引起典型肺炎表征,在小鼠肺部能检测到病毒复制及免疫病理,但高剂量DPP4转导组小鼠肺炎体征与肺病理损伤更明显,病毒复制水平亦高于低剂量DPP4转导组。小鼠感染建模后2w后可检测到结构蛋白特异抗体与中和抗体,高剂量DPP4转导组抗体应答亦明显高于低剂量转导组。本研究以两种剂量DPP4转导小鼠,均成功建立了MERS-CoV感染的小鼠模型,受体DPP4转导水平可影响MERS-CoV感染小鼠体征、病毒复制及抗体应答。     

中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用

目的:为了避免中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染与中和试验中操作活病毒带来的生物安全隐患,构建只具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒,建立MERS假病毒系统,并应用于中和抗体检测。方法:构建含有MERS-CoV S基因的重组质粒pcDNA3.1-MERS-S,与缺失Env基因、含有萤光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获含有假病毒的上清;通过Western印迹、细胞感染实验和血清中和试验,确定是否包装出MERS假病毒,及是否能有效应用于细胞感染与中和试验。结果:MERS假病毒pMERS-S培养上清经Western印迹鉴定出相对分子质量为25×103的HIV-1 P24蛋白和相对分子质量为180×103的MERS-CoV S蛋白;与阴性对照假病毒pEnv-相比,pMERS-S能有效感染MERS-CoV敏感细胞系Huh-7,在感染细胞中产生荧光信号,感染细胞的假病毒量与产生的荧光信号呈明显的量效关系;在MERS假病毒中和试验中,pMERS-S能被MERS-CoV中和抗体中和而失去感染力,反映抗体对MERS-CoV的中和活性。结论:建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统,并有效应用于中和抗体检测,为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了良好的技术支撑手段。     

SARS和MERS中和抗体假病毒检测方法的建立

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均属冠状病毒科(Coronaviridae),能够引起人类严重疾病,特别是SARS-CoV可以导致严重急性呼吸综合征,而且容易造成暴发式流行,引起社会恐慌。本研究利用含有SARS-CoV和MERS-CoV棘突蛋白(Spike protein,S)基因的表达质粒pcD-NA3.1-SS、pcDNA3.1-MS,成功构建了高滴度假病毒,在此基础上通过对病毒接种量进行优化,建立了稳定可靠的假病毒中和抗体检测方法,并通过检测SARS恢复期病人血清以及免疫后小鼠血清对方法的特异性、稳定性以及重复性进行分析,充分证明了该方法是有效的血清中和抗体的检测手段。本研究成功构建了不依赖于BSL-3级生物安全条件的SARS和MERS假病毒,不仅可应用于血清中和抗体检测,还为后续单克隆抗体及抗病毒药物筛选和评价、疫苗研发及病毒感染机制研究等奠定了基础。     

稳定表达hACE2的293T细胞系的建立及功能分析

该研究旨在利用hACE2真核表达载体,通过电转法获得具有新型冠状病毒易感性的稳定表达hACE2的293T细胞株。将线性表达质粒pCMV-hACE2电转至293T细胞,经潮霉素B筛选后,利用间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、Western blot、流式分析法鉴定hACE2的表达,S-RBD蛋白和SARS-CoV-2假病毒分析细胞功能活性。利用250 μg/mL潮霉素B筛选获得了稳定高表达hACE2的细胞系293T-hACE2-D4。在该细胞中,RT-PCR检测到了大量hACE2基因的mRNA,Western blot、间接免疫荧光和流式分析法检测细胞表面hACE2蛋白表达情况(阳性细胞率为86.86%)。功能分析中,293T-hACE2-27-D4细胞不仅能够与SARS-Cov-2 S-RBD蛋白相结合(结合率达84.26%),并且能够成功感染新型冠状病毒假病毒。该研究构建的稳定表达hACE2的293T细胞不仅能与S-RBD蛋白结合,还对新冠假病毒具有易感性,是探究病毒感染机制的有利工具。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白（mRFP）转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只（R3和R4）鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP（R1、R2和R5）或荧光强度（R6）与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只（R1、R2、R3、R4和R5）基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉（RNAi）,并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

复制型HBV转基因小鼠遗传稳定性研究

目的：提高复制型HBV转基因小鼠的遗传稳定性。方法：应用回交传代及双杂交育种法,经荧光定量PCR、ELISA和化学发光法研究HBV基因在小鼠体内的复制与表达。结果：HBV转基因小鼠已稳定传至第23代,血清HBsAg达4122.31±2044.74IU/ml,93.93%的转基因小鼠血清HBV DNA达104-106copies/ml,表达复制水平较早期有显著提高并稳定传代;雌雄小鼠之间表达水平无显著性差异。结论：该转基因小鼠经过培育传代,已成为一个高表达且遗传稳定的复制型HBV小鼠模型。     

中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用

建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8～13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

精子特异性 Sleeping Beauty 转座酶转基因小鼠模型的建立

目的：建立精子特异性表达Sleeping Beauty （ SB）转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具。方法克隆精子特异性启动子用以驱动SB转座酶基因的表达,建立精子特异性表达SB转座酶的载体,利用显微注射方法建立以C57BL/6J为背景的精子特异性表达SB转座酶的转基因小鼠。 PCR鉴定首建鼠的基因型,western blot（WB）和免疫组织化学（IHC）检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果显微注射方式获得了5只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在精子中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了精子特异性高表达SB转座酶转基因小鼠模型,为将SB转座子作为一种基因工程工具应用于小鼠基因修饰模型的建立提供非常重要的工具资源。     

抑癌基因PTEN转基因小鼠的构建及表型初步分析

目的:构建抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的转基因小鼠模型并对其表型进行初步分析。方法:细菌人工染色体(BAC)载体系统构建打靶载体创建PTEN转基因小鼠模型;利用对鼠尾DNA进行PCR检测的方法对出生的F0代小鼠进行基因型鉴定,将阳性F_0代小鼠与野生型小鼠交配繁殖筛选稳定遗传的转基因系。分离并培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF),利用Western blotting检测比较转基因阳性小鼠与同窝野生型小鼠MEF细胞中PTEN的蛋白表达水平,并通过克隆形成实验对比PTEN转基因小鼠与野生型小鼠MEF细胞的增殖能力;取成年小鼠主要组织器官提取蛋白,Western blotting检测PTEN转基因小鼠主要组织的PTEN蛋白表达情况;从小鼠出生后第三周开始统计、分析并制作小鼠的体重生长曲线;此外,还对比了PTEN转基因小鼠与野生型小鼠肺、肝、脾脏的细胞大小与腹腔内的脂肪含量。结论:PTEN转基因小鼠能够存活并稳定遗传;Western blotting结果表明,不论在胚胎期还是成年期,PTEN转基因小鼠体内的PTEN蛋白水平均高于同窝的野生型小鼠,转基因小鼠的PTEN表达水平接近野生型水平的3倍;对PTEN转基因小鼠的整体表型进行初步分析,发现Pten基因在体内过表达后,小鼠的体型显著变小,而细胞大小不变;腹腔内的脂肪含量显著减少。结论:成功构建了PTEN转基因小鼠模型,并获得了生理条件下PTEN过表达的原代细胞系,为研究抑癌基因PTEN的体内生理功能提供了重要的动物模型。     

C57-ras致癌性转基因模型杂交1代的脏器及血液学参数测定

目的测定自主建立的致癌性转基因动物模型C57-ras小鼠杂交F1代的血液生理生化值和主要脏器重量,计算脏器系数并作统计学分析。方法选取同窝C57-ras转基因阳性鼠和BALB/cJ小鼠交配后的杂交1代CB6F1-Tg小鼠,雌雄各半,采血,测量血液生理指标和血清生化指标,并称主要脏器重量。结果血液生理指标中,CB6F1-Tg转基因阳性（＋/-）雌鼠和阴性（-/-）雌鼠间比较,MCHC存在极显著性差异（P〈0.01）;CB6F1-Tg转基因阳性（＋/-）雄鼠和阴性（-/-）雄鼠间比较,PLT、PCT、EOS%、NEUT、NEUT%、LYM%存在显著性差异（P〈0.05）,NEUT%、LYM%存在极显著性差异（P〈0.01）。血清生化指标中,CB6F1-Tg阳性（＋/-）雌鼠和阴性（-/-）雌鼠比较,ALT、TP、ALB存在显著性差异（P〈0.05）,TG存在极显著性差异（P〈0.01）。主要脏器重量和脏器系数均无显著性差异（P〉0.05）。结论测定了新建C57-ras致癌性转基因小鼠模型F1代阳性小鼠和阴性小鼠的主要生物学特性,为该模型在致癌性安全性评价等领域的实际应用中提供参考。     

Slit2基因过表达小鼠的生物学参数及心脏生理功能分析

目的测量评价人Slit2基因过表达小鼠(Slit2-Tg小鼠)的基本生物学参数、心脏超声形态功能及转录组测序等,为该小鼠在生物医学研究应用提供参考。方法观察比较近交系繁育的Slit2-Tg和C57BL/6 J小鼠繁育情况、运用PCR技术确定基因型、采集血液进行血常规及血生化检测、收集脏器组织进行蛋白表达和病理分析,以及对心脏进行超声评价和转录组测序分析。结果 Slit2-Tg小鼠的每窝产仔数显著高于C57BL/6 J小鼠,并可检测到Slit2基因和蛋白高表达。Slit2-Tg小鼠脾的脏器系数有显著增加,但未见组织结构异常。Slit2-Tg小鼠的红细胞、血小板、嗜酸性粒细胞、葡萄糖、球蛋白、尿素氮、甘油三酯、高密度脂蛋白、动脉粥样硬化指数具有显著改变。Slit2-Tg小鼠的心脏除舒张末期左心室前壁厚度较小外,其他指标差异无显著性,其心脏组织受检的17 513个基因中有535基因表达显著升高或降低,主要涉及15个生物进程和信号转导通路。结论完善了Slit2-Tg小鼠生物学参数,并提示了此模式动物亦适用于心血管疾病相关研究。     

新型冠状病毒假病毒制备方法的优化及应用

该文旨在建立一种稳定高效的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒构建方法,并将所制备的假病毒用于评估抗体中和水平。通过比较不同穿梭质粒、质粒配比以及转染试剂对假病毒滴度的影响,优化制备高滴度假病毒的条件;通过制备不同的SARS-CoV-2突变株假病毒,测试该方法的稳定性;利用所制备的假病毒对SARS-CoV-2抗体的中和能力进行评价,测试该方法的可靠性。优化结果表明,当使用Lipofectamine^TM3000作为转染试剂时,pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP?psPAX2?pcDNA3.1-S以0.300μg?0.225μg?0.240μg的质量比转染获得的假病毒滴度最高。进一步,发现利用该方法包装的三种突变株的假病毒均可达到较高滴度。利用该方法制备的假病毒可以用于SARS-Co V-2抗体的中和活性检测,测得IC₅₀值为0.126μg/m L。该研究成功建立了一种简单高效的制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒的方法,其可用于体外评估SARS-CoV-2抗体中和活性,为研发SARS-CoV-2相关疫苗和药物的体外评...     

二肽基肽酶4为人类中东呼吸道综合征冠状病毒MERS-CoV功能性细胞受体

中东呼吸道综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）是继SARS冠状病毒（SARS-CoV）之后新近出现的又一种能够引发严重呼吸道感染的人类新发冠状病毒. MERS-CoV于2012年9月首次在中东一些国家被发现,截至2013年9月7日,MERS-CoV已经引起114例感染病例,其中54人死亡,死亡率约50%. 病毒受体研究为MERS-CoV等人类新发冠状病毒进化和跨种传播机制提供重要依据．最近,Raj等在Nature发表文章,首次报道了二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4,DPP4;又名CD26）为MERS-CoV感染细胞的功能性受体．MERS-CoV功能性受体的发现为人类新冠状病毒溯源和跨种进化研究、病毒传染和流行病学特征分析以及抗病毒药物和疫苗研究提供重要基础.     

Tim-1分子在约氏疟原虫感染模型中的表达分析

Tim-1分子表达在T细胞和调节性B细胞表面,具有促进Th2应答的作用。为探讨Tim-1分子在抗疟疾免疫应答中的作用,利用致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)感染鼠疟模型研究了Tim-1分子表达与小鼠感染结局和免疫应答模式的关系。结果显示,BALB/c小鼠对P.yoelii易感,在感染后6～7 d全部死亡,感染后第3、5天脾内细胞因子IFN-γmRNA水平明显低于对P.yoelii抵抗的DBA2小鼠,而脾IL-10 mRNA水平显著高于DBA2小鼠。BALB/c小鼠脾内Tim-1+T、B细胞百分比在感染后第3、5天显著升高,而DBA2小鼠感染前后脾内Tim-1+T、B细胞百分比没有显著变化。结果提示,Tim-1分子参与抗P.yoelii免疫应答的调节,可能与易感鼠产生高水平Th2型细胞因子有关。     

人载脂蛋白C3基因转基因小鼠的建立及血脂变化分析

目的制备系统性表达人载脂蛋白C3（APOC3）基因的转基因小鼠,建立高血脂小鼠模型。方法将人APOC3基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOC3转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标,脂肪染色观察肝脏脂肪水平。结果建立了高表达人APOC3基因的转基因小鼠品系;转入的人APOC3基因在血液、肝脏、小肠、肌肉、心脏、肾脏、脾脏中均有明显表达;不同月龄转基因小鼠的血浆甘油三酯水平明显高于同龄野生型小鼠;转基因小鼠的肝脏脂肪含量高于野生型小鼠。结论系统性表达人APOC3基因的转基因小鼠表现高脂血症表型,可以作为高血脂以及高血脂相关的心血管病的工具动物。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

人α-乳清蛋白基因的克隆及其在转基因小鼠中高效表达

从粘粒文库中筛选出人α-乳清蛋白基因,构建9.5 kb的转基因表达载体.利用显微注射的方法获得68只F₀代小鼠,经PCR检测和DNA印迹分析证实有8只小鼠（4♂,4♀）为整合人α-乳清蛋白基因的转基因阳性小鼠,整合率为11.7%,整合拷贝数在1至8之间.利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和蛋白质印迹分析,4只雌性F₀代转基因阳性小鼠全部表达了人α-乳清蛋白.放射免疫测定法测定,含量分别为0.62 g/L、0.48 g/L、0.56 g/L、3.21 g/L;同时测定F₀代50号转基因公鼠的后代阳性母鼠（50-2号）乳样中人α-乳清蛋白含量也达到1.03 g/L,证明由原代转基因公鼠遗传给后代的人α-乳清蛋白基因亦获得了稳定的表达.所构建的人α-乳清蛋白转基因载体具有结构较小,表达量高,可以稳定遗传等优点.为利用人α-乳清蛋白基因改善牛乳成分和品质奠定了基础.     

研发动态

<正>中科院微生物所发现新型人冠状病毒感染机制中科院微生物所高福课题组对2012年在中东发现的高致病性新型冠状病毒MERS-CoV进行了研究,发现人CD26分子(又称二肽基肽酶4)是MERS-CoV在细胞表面的受体,从而揭示了该病毒对人的感染机制,相关研究成果发表在最新出版的Nature上。