应用聚合酶链反应检测口蹄疫病毒的实验研究

聚合酶链反应用于直接检测口蹄疫病毒(FMDV),可快速、灵敏地检出乳鼠组织或细胞繁殖的病毒的核酸。其灵敏度可达0.062pg,整个检测过程可缩短至4～5个小时内完成,比其它检测方法都敏感和快速。本文还探讨了直接用PCR扩增合成生物素化核酸探针检测口蹄疫病毒核酸的存在。     

血源性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒核酸筛查系统的建立与应用

目的：建立同时实现乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）、艾滋病病毒（humanImmunodeficiencyVirus,HIV）检测的多重核酸筛查系统。方法：以HBV、HCV、HIV的保守序列为模板设计特异性引物和探针,通过核酸自动提取系统结合一步法RT-PCR技术平台,优化相关反应体系和条件,建立多重多色实时荧光PCR检测血源性传播病毒的核酸筛查系统。将该系统用于101387例血浆样本的筛查。结果：本研究建立的核酸筛查系统特异性好,HBV灵敏度可以达到20IU／ml,HCV灵敏度可以达到100IU／ml,HIV灵敏度可以达到50IU／mL。结论：本研究建立的核酸筛查系统具有高度自动化、高灵敏度、低成本等特点,适合我国血站系统推广使用。     

呼吸道病毒核酸快速检测方案的建立与应用

本研究旨在建立一套便携、准确、操作简便的呼吸道病毒核酸快速检测方案。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证免提取的呼吸道病毒处理试剂(extraction-free respiratory virus treatment reagent,RTU)对病毒核酸处理的效果以及超快速荧光定量PCR仪(FQ-8A)对核酸扩增的效果;将RTU和FQ-8A结合构建呼吸道病毒核酸快速检测方案,通过荧光定量PCR仪中Ct值判断阳性检出率,以验证该方案检测临床样本时的准确性。结果表明,RTU与全自动核酸提取仪在提取效果上灵敏度相当;RTU在提取不同病毒类型样本时,与其他3种提取方法效果相当,但RTU提取时间少于5 min;FQ-8A检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)及腺病毒(adenovirus,ADV)与对照仪器ABI-7500具有良好一致性,kappa系数分别为0.938(P<0.001)和0.887(P<0.001),但FQ-8A耗时更短,扩增时间仅在0.5 h左右;RTU和FQ-8A相结合的快检方案与常规检测方案具有高度一致的检出率,其灵敏度为91.70%,特异度为100%,kappa系数为0.944(P<0.001)。总之,通过RTU与FQ-8A的结合构建了一套可在35 min内完成全部流程的呼吸道病毒核酸快速检测方案。该方案准确性高、操作简便,可为呼吸道病毒快速诊断和治疗提供重要支持。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法的建立

建立狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法,并进行评价和初步应用。针对狂犬病病毒L基因保守区域设计特异性引物、探针,建立PCR反应体系并评价检测体系的扩增效率、灵敏度、特异性和准确性等指标,灵敏度评价结果与现有巢式RT-PCR和基于N基因qRT-PCR检测方法相比较。结果显示本研究建立的基于L基因qRTPCR检测体系扩增效率高于90%;最小检测病毒滴度为2.7×10~(-3)FFU/mL,灵敏度高于基于N基因qRT-PCR和巢式RT-PCR 100倍;最小检测核酸拷贝数为100拷贝,建立了基于目的基因RNA标准品的标准曲线,可用于定量检测;对于我国的狂犬病病毒流行毒株检测范围较广,动物样本检测结果与金标准DFA检测结果相一致,准确性较高。本研究建立的狂犬病病毒qRT-PCR可用于狂犬病病毒实验室检测。     

纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫 病毒核酸的研究

试验旨在探讨利用纳米金标记寡核苷酸探针快速检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。针对小反刍兽疫病毒N基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针,一条探针5’端修饰生物素,另一条探针3’端修饰巯基。巯基化的探针通过Au-S键连接到纳米金颗粒上。靶核酸两端分别与两条探针结合,形成"生物素化探针-靶核酸-纳米金探针"复合物,该复合物通过生物素-亲和素系统,固定在固相载体上,最后银染放大信号。通过肉眼观察法、光镜观察法、分光光度法分析银染灰度,从而间接测定靶核酸的量。初步检测PPRV核酸最低浓度达10fmol/L,所需时间约为1.5h。该方法灵敏度高、操作简单,为临床检测小反刍兽疫病毒核酸提供实验数据和技术支持。     

血源性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒核酸筛查系统的 建立与应用

摘要目的：建立同时实现乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、艾滋病病毒(human Immunodeficiency Virus,HIV)检测的多重核酸筛查系统。方法：以HBV、HCV、HIV 的保守序列为模板设计特异性引物和探针,通 过核酸自动提取系统结合一步法RT-PCR技术平台,优化相关反应体系和条件,建立多重多色实时荧光PCR检测血源性传播病 毒的核酸筛查系统。将该系统用于101387 例血浆样本的筛查。结果：本研究建立的核酸筛查系统特异性好,HBV灵敏度可以达到 20IU/ml,HCV 灵敏度可以达到100IU/ml,HIV 灵敏度可以达到50IU/mL。结论：本研究建立的核酸筛查系统具有高度自动化、高 灵敏度、低成本等特点,适合我国血站系统推广使用。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

实时荧光定量PCR技术在SPF鸡四种垂直传播疾病监测中的应用

目的探讨荧光定量PCR检测技术对SPF鸡四种垂直传播病毒的检测应用。方法采集60份SPF鸡及70份普通鸡群蛋清、泄殖腔试子样品,提取样品核酸,分别进行ARV、REV、CAV、ALV四种病毒实时荧光定量PCR检测,根据标准曲线及溶解曲线分析判读样品病毒拷贝数。结果 SPF鸡ALV 2份阳性,检出率3.3%,其余病毒检测均为阴性;普通鸡样品REV检测2份阳性,检出率2.9%,ALV 10份阳性,检出率14.3%。结论荧光定量PCR检测方法最低可检测到100个拷贝核酸,检测灵敏度较高,有望应用于SPF鸡临床样品的病原检测。     

核酸扩增检测技术用于血液和原料血浆筛查的进展

核酸扩增检测技术是迄今为止检测病毒的最灵敏的方法,它可以明显缩短病毒抗体检测的“窗口期”,降低血源性病毒的传播危险,随着NAT技术在临床检测中应用的不断完善和成熟,其灵敏度和特异性已经能够满足血液筛查的目的。此项技术已经在欧美等国家的血液中心和血液制品行业得到应用和推广。本文就有关近几年NAT技术的应用情况作一综述。     

基于环介导等温扩增技术对人乳头瘤病毒的分型检测

目的:利用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒(HPV)进行快速分型检测。方法:以HPV59、HPV66和HPV68等3种病毒亚型为实验对象,选择合适的特异性核酸序列作为检测的靶序列并构建质粒,针对每个待检靶序列设计若干组扩增引物,并利用构建的质粒筛选出特异性强、灵敏度高的引物组合;将筛选成功的引物加至微流控芯片上,实现人宫颈脱落上皮细胞样本内HPV的快速核酸分型检测。结果:针对HPV59、HPV66和HPV68这3种病毒亚型,设计筛选出具有一定灵敏度的特异性引物,结合微流控芯片,无需对样本进行复杂的核酸提取纯化操作,实现了对临床样本的直接快速检测,整个检测过程在1.5 h内即可完成。结论:LAMP技术可用于临床样本中HPV的分型检测,与微流控芯片结合后操作简单、检测时间短,在临床上有较好的应用前景。     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

EB病毒检测技术研究进展

EB病毒属于人类疱疹病毒Ⅳ型,是一种普遍存在的病原体,可以导致多种疾病。有效的EBV诊断对治疗选择和治疗监测有指导意义。目前实验室用于检测EB病毒的方法主要是血清学方法和核酸检测方法,血清学方法对于EB病毒感染相关疾病的诊断有着重要意义,但是不能监测疾病的发展与转归。核酸检测方法可以直观地反映病毒的存在,灵敏度高。不同的检测方法和标本类型都有着不同的临床意义和适用范围,因此对这些方法进行正确的选择非常重要。这篇综述介绍了目前常见的EB病毒检测方法的进展,详述了各种技术的优缺点,为临床选择适合的检测方法提供参考。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

寨卡病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立

[目的]建立寨卡病毒核酸实时荧光定量PCR超敏检测方法.[方法]选取寨卡病毒基因NS5片段保守序列设计寨卡病毒特异性引物和探针,体外转录建立寨卡病毒标准品(1 ×101 ～1 ×108拷贝/μL);以寨卡病毒标准品为模板,对反应体系探针浓度、退火温度和反应时间进行优化;以标准品为模板,建立标准曲线,并确定检测灵敏度;使...     

CRISPR/Cas系统在生物核酸检测中的应用进展

传统的核酸检测技术耗时长且对操作人员的专业水平要求高,开发精准、快速、便携、低成本、高特异性和灵敏度的新核酸检测系统具有重要意义。目前,CRISPR/Cas系统不但被广泛应用于基因编辑,而且随着部分Cas蛋白“附带切割”活性的发现,灵敏度高、特异性强的CRISPR/Cas系统被逐步开发为新型生物传感工具,用于生物的核酸检测。随着各种Cas效应蛋白的发现,研究人员开发了多种基于CRISPR/Cas系统的核酸检测方法(如SHERLOCK、HOLMES、DETECTR、HUDSON和CASLFA等)可检测各种靶标(包括细菌、病毒、癌症突变等)。笔者综述了当前重要的用于不同靶标检测的CRISPR/Cas系统,包括检测核酸、其他小分子物质及病原微生物,讨论了其面临的挑战和应用潜力,最后推断,随着CRISPR/Cas系统的不断发展和完善,该系统在生物传感及临床分子检测领域的应用会越来越广泛。     

埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。