宛氏拟青霉菌甲醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

[目的]以甲醛降解菌宛氏拟青霉菌F1-23为实验菌株,分离纯化得到甲醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。[方法]从液体培养液中收集菌体,通过细胞粉碎,采用(NH4)2SO4沉淀、透析、DFAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到电泳纯的FADH。[结果]该酶的分子量约为112.81 k Da;亚基分子量分别为65k Da和42 k Da;纯酶液活力为336.10 U/mg,较纯化前提高了4.02倍。对该酶的酶学性质分析结果表明,该酶最适反应温度为37℃,在25~45℃时稳定性很好;最适反应p H为8.0,在p H 6.5~8.0范围内酶活力较为稳定。底物特异性研究表明FADH最适底物为甲醛,相对偏好短链醛类。金属离子对酶活性的影响试验表明,Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ag~+、Fe~(3+)和Hg~(2+)几乎完全抑制FADH酶活力;Ca~(2+)对酶活有促进作用。纯酶液在4℃环境下,在24h内可保存78%的活性。[结论]FADH结构较为特殊,且活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

来源于土壤农杆菌PJD-1-1的碱性β-葡萄糖苷酶的生产、纯化及酶学性质研究（英文）

为从环境中筛选新的β-葡萄糖苷酶生产菌株,利用筛选平板涂布法从腐败的甘蔗叶中筛选目的菌株,从中筛选到1株能产β-葡糖糖苷酶的菌株PJD-1-1,16S r DNA鉴定该菌株为新型的土壤农杆菌。该菌株在20℃,初始p H 7.0,以乳糖为碳源,NaNO_3为氮源的条件下,其酶活性最高为3.92 U/mg。经硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶过滤层析和离子交换层析纯化后(纯化倍数4.85,得率8.0%),SDA-PAGE分析表明得到一条分子量大小为40 k Da条带;该酶的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0;在低于50℃条件下保有较好的稳定性;Hg~(2+)和Ag~+对酶活性有明显的抑制作用,表明该酶的催化活性中心可能含有硫醇基,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Pb~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Na~+、K~+、EDTA和尿素对酶活性没有明显的影响。该酶的温度稳定性、碱性特征以及对金属离子的耐受性等使其在食品及其他领域具有广泛的应用潜力。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

双功能域β-折叠桶碱性植酸酶蛋白序列分析与酶学特性

【目的】表达、纯化来源于Bacillus sp.HJB17的双功能域β-折叠桶碱性植酸酶(phy HT),并对该酶进行蛋白序列以及酶学特征分析,为该酶的广泛应用奠定基础。【方法】应用生物信息学技术,对phy HT蛋白序列进行了生物信息学分析。表达、变复性、分离纯化得到具有酶活性的可溶性phy HT蛋白溶液,通过硫酸亚铁-钼蓝法对phy HT的酶学特性进行了研究。【结果】序列分析结果显示,phy HT由633个氨基酸组成,含有2个植酸酶结构域,属于典型的BPP植酸酶,相对分子量(MW)为69321.68 Da,理论等电点为5.37,为亲水性蛋白。二级结构中,phy HT中α-螺旋(helix)、β-片层(sheet)占主要的比例,高级结构以β片层形成的桶状结构为主。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为35°C,在45°C以下比较稳定。最适的p H为8.0,在p H为6.0–12.0条件之间比较稳定。低浓度的Ca~(2+)以及Mg~(2+)对酶活性有促进作用,Fe~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)等金属离子对酶活性有抑制作用。【结论】本研究成功对phy HT进行了蛋白序列分析以及酶学性质研究,phy HT属于碱性植酸酶,酶活性高、稳定性好,在理论研究和工业生产方面均有很大应用价值。     

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Sn~(2+)和Zn~(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、Zn~(2+)、Ag~+、Sr~(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。     

大球盖菇漆酶的分离纯化及酶学性质研究

从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离漆酶,研究温度、p H和金属离子对酶活的影响。采用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析对大球盖菇漆酶进行分离纯化。以ABTS[2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)]为底物,分光光度法测定酶活。结果表明,纯化后的漆酶比活力为152.79 U/mg,回收率为35.8%。SDSPAGE显示该漆酶为单体蛋白,相对分子质量约40 k D。该漆酶的最适反应温度和p H分别为35℃和4.0,Mg~(2+)、Cu~(2+)对酶活有激活作用,Fe~(2+)、Cd~(2+)、Hg~(2+)则有显著抑制作用。在最优反应条件下,纯化后的漆酶比活力可达222.93 U/mg。     

一株产卡拉胶酶细菌的分离鉴定及其酶学性质

【目的】从红树林土壤腐叶中分离出能够产生卡拉胶酶的菌株,对其进行鉴定,并研究其酶学性质。【方法】利用以卡拉胶为唯一碳源的培养基,分离出产卡拉胶酶的菌株;通过形态学观察、16S r DNA序列分析对其进行种属鉴定;对该菌株所产卡拉胶酶进行纯化并采用DNS测酶活的方法测定酶学性质。【结果】从红树林土壤腐叶中分离出1株高产κ-卡拉胶酶的菌株ASY5,经鉴定该菌株为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.ASY5)。纯化得到的κ-卡拉胶酶的分子量约为30 k Da;酶学性质试验表明,其最适反应温度和p H分别为60℃和7.5,在50℃以下酶的稳定性较好,在p H 7.0-9.0范围内酶活力较稳定,对κ-卡拉胶具有良好的底物特异性,以κ-卡拉胶为底物时Km值和Vmax值分别为2.28 mg/m L和147.06μmol/(min·mg),Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+等对酶活有显著的促进作用,而Ag+、Zn2+、Cd2+及SDS对酶活有强烈的抑制作用。【结论】分离到的细菌假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.ASY5产生的κ-卡拉胶酶在较高的温度和碱性条件下均具有较高的酶活性,为利用卡拉胶水解酶产生卡拉寡糖的研究和应用奠定了基础。     

内生真菌Eupenicillium javanicum R57水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从10株东乡野生稻内生真菌中筛选到7株可转化京尼平苷合成京尼平的菌株,其中菌株R57的转化效率最高,最大转化率可达98.7%。通过菌体形态结合ITS rDNA、18S rDNA及28S rDNA序列分析,将该菌鉴定为爪哇正青霉Eupenicillium javanicum R57。菌株R57的粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、超滤、Ez Fast DEAE FF阴离子交换层析及Sephadex G-150凝胶柱层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,其相对分子质量约为81k Da。该β-葡萄糖苷酶对京尼平苷和4-硝基苯基-β-D-吡南葡萄糖苷(PNPG)均有催化作用,但对京尼平苷的Km值最小,为0.153mmol/L,且催化效率更高;该β-葡萄糖苷酶具有较强耐酸性和耐热性,最适pH 4.6,最适温度60℃。该酶活性受K~+、Co~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)及尿素的激活,但受Cu~(2+)、Fe~(2+)、Mo~(3+)、Pb~(2+)及SDS不同程度的抑制。     

诺卡氏菌腈水合酶基因在重组毕赤酵母中的表达

为从基因水平上改造腈水合酶,进行了诺卡氏菌腈水合酶基因的外源表达研究。在重组大肠杆菌表达系统内,腈水合酶的α亚基几乎不能正常表达,在重组E. coli BL21(DE3) (pET32aNHBAX)中,腈水合酶活性仅为0.04U/mg。构建重组毕赤酵母表达质粒pPIC3.5kNHBAX,采用电穿孔转化法将其转入宿主菌P. pastoris GS115中,经过菌株培养和腈水合酶的诱导表达,筛选获得了优选菌株P. pastoris NH4。对P. pastoris NH4的细胞培养和腈水合酶的诱导表达条件进行优化,结果表明,重组腈水合酶在毕赤酵母中的表达水平可以达到0.52U/mg,但不能稳定积累。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.