卵泡刺激素受体FSHR234纳米抗体的分离纯化及多克隆抗体的制备

【背景】卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在人体成熟破骨细胞及单核细胞表面表达,成为阻断卵泡刺激素(FSH)作用的潜在靶点,制备亲和力较高的FSHR抗体已成为靶向治疗FSH相关疾病的切入点。【目的】构建FSHR重组载体获得表达量较高的可溶性蛋白,进一步制备骆驼多克隆抗体及其纳米抗体。【方法】利用XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切重组质粒p ET30a-FSHR234,将目的基因fshr构建于p GEX-4T-1载体并进行原核表达,利用Western blot及ELISA检测目的蛋白的配体结合能力。免疫新疆双峰驼制备骆驼多克隆抗体,并利用噬菌体展示技术筛选获得FSHR纳米抗体。细胞免疫化学法检测FSHR抗体在coav-3的表达情况。【结果】构建了pGEX-4T-1-FSHR234重组质粒,获得了表达量较高的FSHR234可溶性蛋白;并构建了5株FSHR纳米抗体,鉴定出一株结合能力较强的纳米抗体,命名为VHH-3F9。【结论】制备的骆驼FSHR多克隆抗体效价达1:128 000,筛选获得的VHH-3F9纳米抗体能与FSHR234具有较高的结合性,且两者均能表达于coav-3细胞表面。     

卵泡刺激素及其受体与肿瘤的相关性

卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)被认为只表达在人和哺乳动物的睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞中,在生殖中具有重要作用。最近研究发现,FSHR在多种肿瘤血管内皮细胞表面特异表达,这引起了研究者对该受体与肿瘤尤其是与肿瘤血管形成之间关系的关注。本文主要对FSH和FSHR信号通路及其病理意义和在肿瘤中的作用等方面的研究进展进行综述。     

大鼠胃卵泡刺激素及其受体的免疫荧光定位及原位杂交

目的探讨大鼠胃组织中是否表达卵泡刺激素（FSH）及其受体（FSHR）,为进一步研究FSH对消化系统的功能调节提供理论依据。方法选取SD大鼠20只,雌雄不拘,经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉成功后,用4％多聚甲醛先快后慢灌流固定2h,开腹取胃组织置于300g／L蔗糖液中直至组织沉底,恒冷箱切片机切成厚度为6／zm的组织切片用于单标记免疫荧光定位研究。另一部分胃组织放入4％多聚甲醛室温固定6—8h,按石蜡包埋程序包埋后制成4pm石蜡切片用于原位杂交研究。结果在大鼠胃底腺的壁细胞和主细胞呈FSH和FSHR免疫反应阳性,阳性物质分布于细胞质,细胞核呈阴性反应;上述细胞同样含有FSH和FSHRmRNA杂交信号,信号物质亦分布于细胞质内,细胞核呈阴性反应。结论FSH及其受体定位于大鼠壁细胞和主细胞,同时大鼠壁细胞和主细胞又能产生FSH及其受体,说明FSH对壁细胞和主细胞功能作用可能是通过旁分泌或自分泌的作用来实现的。     

卵泡刺激素新的代谢调控功能及对衰老的影响

卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)曾一度被认为只在生殖过程中发挥作用:促进女性卵泡的发育和成熟及男性精子的生成;然而近十年来,大量研究不断发现FSH在代谢调控中发挥新的功能,甚至对衰老产生影响。FSH通过与其受体(FSH receptor, FSHR)结合调节两性的骨质生成、脂肪代谢、能量代谢和胆固醇生成、心血管疾病的发生。FSH代谢调控作用提示阻断FSH对治疗一系列与年龄相关的疾病,包括骨质疏松症、肥胖症、血脂异常、心血管疾病,甚至预防衰老有潜在价值。     

不同波段电磁辐射对大鼠Sertoli细胞雄激素受体和卵泡刺激素受体表达的影响

探讨不同波段电磁辐射对大鼠睾丸Sertoli细胞雄激素受体(androgen receptor,AR)和卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)表达的影响。原代培养的Sertoli细胞分别经场强6×104 V/m的电磁脉冲(electromagnetic pulse,EMP)、平均功率密度为100 mW/cm2的S波段微波(S-band high power microwave,S-HPM)和X波段微波(X-bandhigh power microwave,X-HPM)辐射4 min。应用real-time RT-PCR和Western blot方法检测Sertoli细胞AR的表达,结果显示具有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01);Wistar大鼠分别经S-HPM、X-HPM和EMP照射20 min,应用免疫组化方法检测睾丸组织AR的表达,发现辐射后7 d有显著降低(P<0.05,P<0.01)。三者比较,AR的表达总体呈EMP>X-HPM>S-HPM的趋势,而FSHR的表达无明显变化。Sertoli细胞AR表达的变化,可能参与了电磁辐射致...     

雄激素受体融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

将雄激素受体的ｃＤＮＡ片段克隆到表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ内,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性表达产物ＧＳＴ－ＡＲ。用该融合蛋白制得的兔多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和吸附纯化后,表现出较好的抗ＡＲ的专一性,可用于ＡＲ结构和功能的研究。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

抗人DR5多克隆抗体的制备与纯化

目的:分离纯化融合蛋白GST-eDR5,免疫小鼠制备抗人DR5多克隆抗体.方法:用GST纯化试剂盒和电泳两次纯化的融合蛋白GST-eDR5免疫小鼠,制备抗CST-eDR5抗血清,然后用GST纯化得到抗人DR5抗血清.通过Westem blot、ELISA方法鉴定抗血清特异性和效价.结果:通过亲和纯化得到了高纯度的融合蛋白GST-eDR5,其浓度为0.65μg/μl.免疫产生的DR5抗血清特异性高,且效价高达1:25600,纯化后的抗人DR5抗血清不再识别GST,只识别人DR5.结论:成功制备了高特异性、高效价的抗人DR5多克隆抗体,为深入研究其对肿瘤细胞的生长抑制和凋亡作用提供了实验工具.     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的 制备硫氧还蛋白1 （thioredoxin-1,Trx-1）多克隆抗体.方法 从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40 d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化.用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果.结果 成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体.结论 此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究.     

抗谷胱甘肽S转移酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的:制备谷胱甘肽S转移酶(GST)的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法:用纯化的GST标签蛋白(纯度>98%)免疫新西兰大白兔,获得GST的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性,并与商业化抗体进行对比。结果:通过免疫法得到了GST的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1∶1×106,经rProtein A柱纯化后获得了高效价高特异性的抗体,其高效高特异性已达商业化抗体水平。结论:获得了GST的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

斑马鱼基因ATF4多克隆抗体的制备

ATF4是含有bZIP结构域的ATF／CREB转录因子家族成员,对胚胎的发育以及细胞的增殖、分化有重要的调节作用。制备ATF4的多克隆抗体对于研究其在斑马鱼心脏发育过程中的作用有重要的意义。研究首先通过生物信息学方法,选择ATF4基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列（1017bp）,通过PCR扩增,将片段重组到原核表达载体pET-28a,然后转化入Rosetta菌株中。经测序鉴定正确后,用IPTG诱导表达融合蛋白,以该融合蛋白免疫小鼠,获得ATF4多克隆抗鼠血清。对该多抗血清抗体进行验证,具有很好特异性和较高效价,可以用作Western—blotting、免疫印迹等试验分析。     

除草剂2,4-D特异性多克隆抗体的制备及鉴定

目的是制备特异性的2,4-D多克隆抗体.用活性酯和混合酸酐法将半抗原2,4-D分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联;以2,4-D-BSA作免疫原免疫两只新西兰白兔;以2,4-D-OVA包被96孔酶标板,用间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗血清效价和竞争性ELISA法检测2,4-D.结果显示2,4-D与BSA和OVA的偶联比率分别为32∶1和18∶1,抗血清效价＞6.4×105,在优化条件下2,4-D的最低检测限达37ng/mL.实验成功地制备了2,4-D特异性多克隆抗体,为其ELISA方法的建立提供了条件.     

番茄乙烯信号转录因子LeERF2多克隆抗体的制备

目的:作为番茄乙烯信号转录因子,LeERF2是在蛋白水平单独或同其他蛋白质协同与启动子或增强子相结合发挥其调控功能的,蛋白质的调控机制是信号转导领域中的关键研究内容。本研究目的是制备LeERF2抗体用于探讨番茄乙烯信号转录因子LeERF2在蛋白水平的生物活性及其生物学功能。方法:通过免疫新西兰大耳白雄兔和DEAE-52离子交换柱纯化分离制备了抗LeERF2多克隆抗体。结果与结论:抗体的效价大于10000,纯度达到了99%,Western印迹检测纯化后抗LeERF2多克隆抗体具有免疫特异性。     

苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备及MdSUT1蛋白表达特异性分析

高等植物光合同化产物蔗糖的质外体运输主要是靠蔗糖载体蛋白来完成的。MdSUT1是从苹果果实中克隆的蔗糖载体家族基因,本文将MdSUT1构建到酵母表达载体pMETαB,重组质粒转化毕赤酵母PMAD16经0．5％甲醇诱导后获得Md—SUT1表达。纯化的MdsuT1异源表达蛋白免疫Balb／C小鼠制备多克隆抗体,抗体特异性分析结果显示该抗体对酵母表达和苹果中的MdsuT1识别具有较高的特异性。免疫共沉淀实验结果也证明抗体能够应用于苹果果实中MdSUT1的功能分析。     

果蝇心脏发育标记基因Kruppel的多克隆抗体制备

Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能,需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析,选取适当区域进行引物设计,从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列,并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒（pET-28a-Kruppel）转化rosetta受体菌,通过IPTG（Isopropylβ-D-thiogalactoside）诱导表达融合蛋白,用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体的效价。     

斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体的制备及检测

Foxp4为Fox基因家族的一员,目前研究发现其与肺、肠、心脏以及中枢神经系统的发育有关.为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体.按照巢式PCR原理,经过两次PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Foxp4基因片段,将其克隆人表达载体pGEX4T-1,转化至大肠杆菌BL21中,再通过1PTG进...     

卵泡刺激素和雌激素对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响

在动物体内多种激素共同调控着卵巢生殖细胞的生长、发育和成熟,其中促性腺激素起着至关重要的作用。本实验建立了鸡胚(18日胚龄)卵巢构建生殖细胞和体细胞的共培养模型,并研究卵泡刺激素(FSH)、17B雌二醇(E2)以及二者联合处理对生殖细胞增殖的影响。结果发现FSH(0．25-1．0IU／mL)、E2(10-1000ng／mL)处理48h后均可显著促进生殖细胞的增殖,FSH与E2共同处理作用更加显著且高于其单独处理组,表明FSH和E2可协同刺激鸡胚卵巢生殖细胞的增殖,FSH可能是通过促进雌激素或其受体的合成而发挥作用。     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。