抗结核分枝杆菌RpfB结构域单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌Rpf B结构域单克隆抗体。方法:将p PRO-EXHT-Rpf B domain原核表达载体接种于大肠杆菌DH5中,用IPTG诱导表达Rpf B结构域蛋白,以纯化的Rpf B结构域蛋白作为免疫原,皮下包埋免疫小鼠3次,每次间隔2周;分离小鼠的脾细胞,与Sp2/0细胞融合,克隆化制备抗Rpf B结构域单抗,ELISA检测其效价,鉴定其特异性和相对亲和力,观察制备的抗Rpf B结构域单抗对Rpf家族其他蛋白的识别能力及其对结核分枝杆菌和藤黄微球菌的生长抑制作用。结果:制备了3株抗Rpf B结构域单抗,特异性高,亲和力较强,均能特异性识别Rpf B结构域。经小鼠腹腔注射制备腹水并纯化,获得了较高纯度的单抗,所制备的抗Rpf B结构域多肽的单克隆抗体可以识别多种Rpf样蛋白及其结构域蛋白。在抗体滴度为1∶1000时可有效抑制Rpf B结构域对结核分枝杆菌H37Ra和藤黄微球菌的生长促进作用,提示抗Rpf B结构域单抗可能会抑制进入机体内生长停滞或潜伏感染的结核分枝杆菌的再次激活,可能具有预防隐性感染复发的作用。结论:抗Rpf B结构域单抗的制备为进一步研究Rpf B结构域的生物学和免疫特性提供了实验工具。     

微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用

微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白(PrP)之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白(PrP^C)和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白(PrPSc)相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrPC和PrPSc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列(23~91 aa). PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.     

共表达HIV-1中国流行株gp120与IL-18重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性观察

为筛选我国的HIV-1疫苗候选株,以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,并将该重组鸡痘病毒免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果显示,HIV_1外膜蛋白gp120和IL-18不但可在重组鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中表达,而且可在重组鸡痘病毒感染的哺乳动物细胞中表达。重组病毒具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应,且IL_18发挥了免疫佐剂的作用。本研究结果为制备安全、有效的HIV-1基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单抗的制备

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于²⁹⁷NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI³²²,对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。     

抗Ⅱ型登革病毒蛋白抗体的制备和特点分析

本研究旨在制备和鉴定小鼠抗Ⅱ型登革病毒（DENV‐2）10种蛋白的抗体,为后续相关研究提供实验材料。利用真核表达载体pReceiver构建DENV‐210种蛋白的重组质粒,提取质粒 DNA ,肌内注射免疫小鼠,共免疫4次。末次免疫后2周取小鼠血清,利用DENV‐2感染的Vero细胞和DENV‐2各蛋白的稳定表达细胞,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光法（IFA）和蛋白免疫印迹法评价免疫效果,分析抗体的特点。DNA免疫小鼠后获得抗DENV‐210种蛋白的抗血清,抗体效价波动于1∶400～1∶16127之间,以抗E蛋白抗体效价最高,达1∶16127,而抗NS3、NS4b、NS5蛋白抗体效价较低,仅为1∶400。利用DENV‐2感染的Vero细胞和稳定表达病毒蛋白的EAhy926细胞进行IFA染色,抗DENV‐2各蛋白的抗血清均可特异性识别DENV‐2抗原。蛋白免疫印迹结果显示,抗E、NS1、NS4b和NS5蛋白抗体能识别热变性蛋白,其他抗血清未呈现阳性反应条带。本研究提示,DNA免疫小鼠所获得的抗DENV‐2各蛋白抗体能特异性识别自然感染或模拟自然感染状态下的DENV‐2蛋白,可为后续相关研究提供工具,也表明DNA免疫法可作为抗体制备的一种策略。     

1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定一组抗曲霉不同抗原的单克隆抗体。方法采用烟曲霉细胞壁抗原成分、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠菌属抗原的交叉反应。结果获得29株稳定分泌抗曲霉单抗的杂交瘤细胞株,其中用烟曲霉细胞壁抗原成分免疫获得11株,用分泌抗原免疫获得13株,用孢子免疫获得5株;Ig亚类鉴定,11个克隆株为IgG1亚类,3个克隆株为IgG3,15个克隆株为IgM。免疫荧光法鉴定29株单抗特异性识别烟曲霉细胞壁抗原,与其他曲霉抗原有交叉反应。结论29株单克隆抗体,对于建立侵袭性曲霉感染早期诊断方法、筛选曲霉保护性抗体以及研究抗体保护机制奠定了实验基础。     

人vasorin蛋白胞外结构域单克隆抗体的纯化及应用

目的:纯化人vasorin(VASN)蛋白胞外结构域的单克隆抗体并鉴定。方法:用表达人VASN蛋白胞外结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞免疫小鼠,收集腹水,纯化抗体;ELISA检测单抗的特异性和亲和力,Western印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光等实验检测单抗的特异性与可能的用途。结果:纯化获得2株抗VASN胞外结构域单抗V20和V21,ELISA结果显示二者均特异性强、亲和力高;Western印迹显示2株单抗均可结合Hep G2细胞中的VASN蛋白,以V20为佳;免疫共沉淀实验结果显示V21能够钓取Hep G2细胞中的VASN蛋白及细胞培养上清中的分泌型VASN;免疫荧光实验结果显示V21能与Hep G2细胞的VASN蛋白结合。结论:纯化获得2株抗人VASN胞外结构域单抗,为进一步研究VASN蛋白的生物学功能提供了实验工具。     

肺炎衣原体单克隆抗体的研制和应用

目的:以杂交瘤技术制备抗肺炎衣原体(Cpn)单克隆抗体,用于衣原体感染的诊断及相关疾病的研究。方法:以进口Cpn抗原免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA法筛选抗体阳性杂交瘤细胞。收集接种过杂交瘤细胞的小鼠腹水,分别用ELISA法检测抗体效价、用免疫琼脂扩散试验鉴定单抗的类别、用微量荧光免疫试验(MIF)检测单抗的种属特异性。用克隆表达的主要外膜蛋白(MOMP)通过Dot-ELISA法分析单抗的特异性。通过建立直接免疫荧光法(DIF)检测病人和正常人外周血单核细胞(PBMC)标本,并进行统计处理。结果:小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞的融合率为61.46%(236/384),最终获得4株稳定分泌Cpn单抗的细胞株。用ELISA法检测小鼠腹水,效价高者可达1∶100000。免疫琼脂扩散试验鉴定为IgG类单抗,扩散效价达1∶128。自制单抗能与重组MOMP发生结合反应,表明其为抗CpnMOMP抗体。自制单抗与进口单抗类似,即与鹦鹉热衣原体(Cps)出现一定程度的交叉反应,而与沙眼衣原体(Ct)则无交叉反应。对240份PBMC标本用自制单抗和进口单抗同时检测Cpn抗原,2种单抗检测均阳性的共86份,经SPSS软件分析两者具有较好的一致性。DIF检测显示,心血管疾病和呼吸道疾病Cpn抗原阳性检出率分别为69.34%(95/137)和72.06%(49/68),与正常人标本Cpn抗原阳性率相比,均具有显著性差异。结论:获得IgG类抗CpnMOMP单抗,自制Cpn单抗的特异性和敏感性均与进口单抗具有较好的一致性。PBMCCpn抗原检测的统计分析证实,对于动脉粥样硬化等某些疾病的发生和发展,Cpn感染可能是重要的原因之一,但其中的因果关系还有待深入研究。     

MiniSOG蛋白的单克隆抗体制备及初步研究

单线态氧产生者(mini singlet oxygen generator,miniSOG)是改造于拟南芥向光素2蛋白而获得的小分子荧光黄素蛋白,由106个氨基酸残基组成。miniSOG被广泛用于电镜及荧光显微镜,并被广泛用于发色团辅助的光灭活(Chromophore-assisted light inactivation,CALI)蛋白、DNA或RNA,并结合免疫光敏用于癌症的治疗,以及结合细胞消融用于神经科学、免疫生物学等。但是目前国内并无商品化的miniSOG抗体,为了辅助课题研究,制备抗miniSOG蛋白的单克隆抗体,本研究根据miniSOG基因的ORF区序列构建miniSOG-GST重组蛋白的原核表达载体PGEX-4T-1-miniSOG,然后将该重组质粒转化于BL21感受态大肠杆菌中,异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-DThiogalactoside,IPTG)诱导融合蛋白的表达,并经亲和层析方法进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。筛选获得稳定分泌抗miniSOG的单克隆抗体细胞株,最终选取性能最优的4F9细胞株进行小鼠腹水制备并纯化。单抗4F9亚型为IgG1/Kappa,腹水滴度达到1∶200 000,纯化抗体灵敏度达到5 ng/mL。并通过Western Blot、免疫荧光及免疫组化方法进行特异性鉴定,该单克隆抗体能特异性识别转染细胞和转基因小鼠脑组织中的miniSOG蛋白。本研究在国内首次制备了miniSOG单克隆抗体,将丰富其在其它方面的应用。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

P2X7受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备与鉴定鼠抗P2X7受体的蛋白单克隆抗体.以人P2X7受体的胞外段制备短肽作为抗原,皮下注射免疫Balb/c小鼠.分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定P2X7其生物学效应.结果显示,获得1株稳定分泌抗人P2X7受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG1,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶6.4×104;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western blotting检测证明该单抗与人细胞表面的P2X7受体蛋白特异地结合.所制备的抗人P2X7受体的单克隆抗体具有高度的特异性及稳定性,为针对P2X7受体为靶点的抗体药物的开发应用、疾病的辅助诊断奠定了基础.     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

基因免疫制备西尼罗病毒NS5蛋白特异性单抗

研究了NS5蛋白在西尼罗病毒的特异性检测方面的应用及NS5在黄病毒复制中的作用机理。采用RT．PCR方法扩增了西尼罗病毒株的NS5基因片段,将其克隆至真核表达载体pVAX1,构建真核表达质粒。以重组质粒免疫BALB／c小鼠后取脾脏进行杂交瘤细胞融合,建立能稳定分泌西尼罗NS5单克隆抗体的杂交瘤细胞株。构建了真核表达质粒pVAX1-WNV—NS5,免疫动物后获得了28289等4株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,均为IgM型。真核表达质粒免疫后成功地诱导了针对NS5蛋白的体液免疫应答,单抗特异性分析显示4株单抗与其他黄病毒存在一定交叉反应。     

抗天花粉蛋白IgE单抗的抗独特型抗体及其鉴定

为了研究抗独特型抗体对天花粉蛋白特异的IgE反应的调节作用,建立了分泌针对天花粉蛋白的IgE单抗的独特型决定簇的大鼠-小鼠异种杂交瘤细胞株(6 C_5)。以分泌抗天花粉蛋白IgE单抗的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株(TE—1)诱生的腹水,通过免疫亲和层析,分离得到TE-1单抗免疫Wistar大鼠。将免疫大鼠脾细胞与小鼠骨髓细胞(NS-1)进行异种间细胞融合,通过严格的筛选和克隆化,最终得到3侏生长稳定、连续分泌抗体的异种杂交瘤细胞株(6 C_5、3 E_3和8 G_6),并能顺利地经受冰冻保种和复苏。用间接ELISA法对所获得的单抗进行鉴定,即比较三个单抗对下列包被抗原的反应性,其中包括TE-1(天花粉蛋白特异的IgE单抗)、3A 12(天花粉蛋白特异的IgA单抗)、ADNP和142(抗DNP IgE单抗,来自两个不同的杂交瘤株),以及M Ig(正常小鼠血清Ig)。结果表明6C_5单抗只与TE-1呈阳性反应,对其余各种包被抗原的反应均呈阴性,说明杂交瘤株6C_5具有抗TE-1单抗独特型决定簇的特异性,实验经多次重复,因此可以结论,成功地建立了一株能分泌抗独特型抗体的异种淋巴细胞杂交瘤株。此外,8G_6与所有包被抗原均呈强阳性,说明它具有抗各类小鼠Ig共同决定簇的特异性。3 E_3的特异性尚未最终确定。在方法学上的改进包括细胞融合时所用的HAT选择培液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的剂量较常量加倍,而氨基喋呤的剂量较常量减半。并且缩短在HAT培液中和HT培液中培养时间。这些可能为杂种淋巴细胞杂交瘤株的建立提供了有利条件。为了保证ELISA检测的特异性,作包被抗原的TE-1单抗与免疫大鼠用的TE-1单抗的来源不同,它来自无血清培养液培养的TE-1的上清液。同时,间接ELISA法所采用的酶联第二抗体(兔抗大鼠Ig),通过小鼠Ig的吸收等,证明其与小鼠Ig无交叉反应后才使用。     

人突触囊泡蛋白2C单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备人突触囊泡蛋白2C(SV2C)单克隆抗体。方法:纯化SV2C/L4蛋白,免疫BALB/c小鼠并制备杂交瘤细胞,筛选针对SV2C/L4的特异性抗体,鉴定亚型及测定效价;选取效价最高的抗体进行大量制备,并经SDSPAGE、Western印迹、间接ELISA和动物实验对抗体纯度、特异性、亲和力及中和活性进行检测。结果:得到纯度大于95%的SV2C/L4蛋白,经2轮筛选共获得13株鼠单抗,抗体重链大多为IgG1、IgG2a型,轻链均为κ型;选取效价最高的30号抗体进行大量制备,纯化后抗体的纯度大于99%,亲和力为6.7 nmol/L,中和活性为100 LD50/mg。结论:筛得1株高亲和力、具有中和活性的特异性SV2C鼠单抗,为肉毒中毒的治疗提供了新的选择,也为阐明Bo NT/A受体间的关系奠定了基础。     

日本血吸虫重组信号蛋白14—3—3的纯化及单克隆抗体的制备

纯化日本血吸虫（中国大陆株）重组信号蛋白（rSj14—3—3）,并制备其单克隆抗体。以纯化后的rsj14-3—3蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rSj14-3-3的单克隆抗体,并通过ELISA方法和Westernblotting测定抗体的效价与特异性。获得了大量高纯度的rSj14-3-3蛋白：筛选出了能够稳定分泌抗rSj14．3．3单抗的杂交瘤细胞株3H6。单抗亚型为IgG1。实验依靠大肠杆菌表达系统高效表达了rSj14—3—3蛋白,并利用该蛋白制备了单克隆抗体．可用于今后血吸虫病免疫诊断的实验研究。     

抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析

在本实验室研制出的多株针对H5N1亚型禽流感血凝素单抗中,13D4单抗对所有H5亚型病毒均有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强和识别广的特点,且在小鼠实验中显示了对各种代表株禽流感的感染和发病均具有良好的治疗效果。在此研究基础上,本实验通过基因工程构建含有13D4单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达和纯化。经过竞争法和血凝抑制检测其活性,表明获得的单链抗体具有与原始鼠源抗体相近的反应活性和相同的识别表位。H5N1广谱中和单抗13D4的单链抗体的成功构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础。     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制

目的：利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗,研制定量检测心肌型脂肪酸结合蛋白（ H-FABP ）的ELISA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠,以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗,用这些单抗研制定量检测H-FABP的ELISA 试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株,研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒,灵敏度达到0．2 ng/mL,线性范围0．4～25 ng/mL,r2＝0．9967,回收率在97．2％～104．5％,精密度的变异系数（CV）≤6．72％;应用此试剂盒检测健康人血浆H-FABP,含量为1．87～8．50 ng/mL。结论所研制的ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中H-FABP含量的检测。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。