胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表达及其对禽流感灭活疫苗的佐剂效应

胸腺五肽(Thymopentin,TP5)和法氏囊活性五肽(Bursopentin,BP5)均具有重要的免疫学功能,但二者在基因水平上的联合应用尚未见报道。为研究TP5和BP5形成的重组融合肽TP5-BP5(TBP5)是否具有免疫佐剂活性,根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成重组融合肽TBP5编码序列,将其克隆至p ET-32a表达载体中,重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,并采用MTT法检测其表达产物的体外活性。同时以TBP5联合H9N2型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)灭活疫苗免疫小鼠,检测免疫后小鼠的HI抗体、HA抗体效价和细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平,并通过动物免疫保护试验来评价其对小鼠的免疫保护作用。结果显示,TBP5在大肠杆菌中获得表达;TBP5能显著促进小鼠胸腺T淋巴细胞和脾脏B淋巴细胞的增殖,并能增强机体免疫后HI抗体和HA抗体效价、提高细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平,表明TBP5既能增强机体体液免疫应答,又能增强细胞免疫应答。动物免疫保护试验结果显示TBP5有助于小鼠肺脏中H9N2型AIV病毒的清除。结果表明,重组融合肽TBP5具有良好的免疫佐剂的潜能,为进一步研究开发新型疫苗佐剂奠定了基础。     

牛樟芝免疫调节蛋白的过量表达及活性分析

[目的]用大肠杆菌高效表达牛樟芝免疫调节蛋白(Antrodia camphorata immunomodulatory protein,ACA)。[方法]借助DNAworks3.2.4设计引物合成大肠杆菌密码子偏好性的ACA基因,构建于pET-32a和pGEX-4t-2,转化大肠杆菌,测序后分别命名为pET-32a-ACA/BL21 和pGEX-4t-2-ACA/BL21;探索密码子偏好性、载体、培养基种类和诱导条件对ACA表达的影响并使用响应面法优化蛋白表达。纯化重组ACA (recombinant ACA,rACA)并干预小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过测定rACA对巨噬细胞增殖能力、吞噬能力、细胞形态及产NO、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、白介素lβ(interleukin-1β,IL-1β)等细胞因子能力的影响来评估rACA的活性。[结果]pET-32a-ACA/BL21更适合ACA表达;在优化的SOB (酵母粉8.92 g/L)中培养pET-32a-ACA/BL21,添加0.42 mmol/L IPTG 25℃诱导7 h时rACA以可溶性表达为主,产量达187.122 μg/mL,是目前大肠杆菌表达真菌免疫调节蛋白的最高报道。纯化的rACA能显著促进小鼠巨噬细胞增殖、提高细胞的吞噬活性和改变细胞形态,显著诱导巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。[结论]rACA的高效可溶性表达及类似天然ACA的活性使它可以替代天然ACA作为制药行业的食品添加剂或者免疫调节剂,甚至可以用于药物研究。     

IL-17作为分子佐剂增强蛋白疫苗细胞免疫应答的研究

目的:为了进一步增强重组蛋白质疫苗的细胞免疫应答,利用重组的IL-17作为分子佐剂,与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)一起免疫小鼠,研究IL-17作为分子佐剂对适应性免疫的影响,探索IL-17对蛋白疫苗诱导的免疫反应,特别是细胞免疫应答的影响.方法:用OVA作为特异性蛋白疫苗,与不同剂量的IL-17联合免疫C57...     

粘膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究

采用原核表达的戊型肝炎病毒结构区基因(HEV ORF2)编码蛋白,与新型人用疫苗佐剂类MF59配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果。结果表明,通过滴鼻和灌胃两种粘膜免疫途径免疫BALB／c小鼠,均能诱导小鼠产生针对HEV ORF2试验性疫苗的血清IgG和IgA,血清IgG的抗体滴度为1：800～1：1600,血清IgA抗体滴度为1：100～1：200。对免疫小鼠血清中IgG的动态观察表明,血清抗体可持续存在至少6个月以上。比较类MF159佐剂和传统铝盐佐剂经注射免疫所诱导产生的血清IgG抗体滴度,发现类MF59佐剂可有效增强HEV0RF2重组蛋白的免疫原性4倍左右。类MF159佐剂可诱导粘膜免疫反应,在肠道粘膜部位产生SIgA,滴度为1：100。这些结果为新型戊型肝炎病毒基因工程重组疫苗的研制提供了一条新的思路。     

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。     

GM-CSF和IL-4增强Aβ表位DNA疫苗的免疫原性研究

目的:探究和评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)作为β淀粉样蛋白(Aβ)表位DNA疫苗的分子佐剂,增强DNA疫苗体液和细胞免疫反应的水平。方法:阿尔茨海默病DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T分别与重组DNA分子佐剂p VAX1-S-IL-4和p VAX1-S-GM-CSF联合免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。结果:分子佐剂IL-4组相比单独的DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T组抗体水平具有一定程度的提高;GM-CSF能明显提高DNA疫苗Aβ特异的抗体水平和泛DR辅助T细胞表位(PADRE)特异的细胞免疫反应,4次免疫后其抗体滴度提高了4倍。结论:GM-CSF佐剂能够有效地用于今后阿尔茨海默病DNA表位疫苗的研究中。     

肺炎链球菌候选蛋白疫苗DnaJ-△A146Ply通过PI3K/Akt和NF-κB信号通路刺激巨噬细胞诱导免疫应答

本实验目的是研究肺炎链球菌r Dna J-△A146Ply融合蛋白引起小鼠巨噬细胞的免疫应答机制。原核表达r Dna J-△A146Ply重组蛋白,Ni+柱纯化后去除其内毒素。r Dna J-△A146Ply刺激小鼠来源腹腔巨噬细胞6 h后,提取细胞RNA,RT-PCR检测白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)m RNA表达水平。24 h后取细胞培养上清,ELISA检测IL-6和TNF-α蛋白表达水平。信号通路抑制剂预处理腹腔巨噬细胞1 h后加蛋白刺激,ELISA检测上清中IL-6、TNF-α蛋白表达水平抑制情况。取不同时间点处理的细胞进行免疫印迹(Western Blot),检测p-Akt和p-NF-κB表达水平。制备获得纯度90%以上、内毒素含量小于0.1 EU/μg的r Dna J-△A146Ply融合蛋白;r Dna J-△A146Ply可刺激腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-αm RNA及蛋白水平表达明显上调、增强Akt和NF-κB磷酸化;Akt和NF-κB抑制剂可显著减少IL-6和TNF-α表达。因此,r Dna J-△A146Ply融合蛋白通过Akt和NF-κB信号通路刺激巨噬细胞诱导免疫应答。     

不同佐剂肾综合征出血热纯化疫苗体液免疫效果的研究

在肾综合征出血热(HFRS)纯化疫苗原液中分别加入Al(OH)3、IL-2、GM-CSF、CFA等佐剂的一种或两种,以不加佐剂的纯化疫苗原液作为对照,分别免疫BALB/c小鼠,定期进行眼眶采血,用ELISA法检测血清中抗HFRS病毒的抗体水平。用不同佐剂的HFRS纯化疫苗免疫BALB/c小鼠后,其抗体产生的时间和滴度均不同。佐剂组与对照组相比抗体产生早且(或)滴度高,IL-2佐剂组在免后第3天就可以检测到抗体;联合使用两种佐剂组与单独使用一种佐剂组相比,抗体产生早、滴度高。结果表明,上述各种佐剂对HFRS纯化疫苗诱导BALB/c小鼠产生的免疫应答均有一定的增强作用;IL-2对早期免疫应答、早期抗体的产生有显著意义;联合应用两种佐剂疫苗的免疫效果优于只加其中一种佐剂的疫苗。     

HEVAg-PLGA纳米颗粒疫苗小鼠体内免疫学研究

研究重组戊型肝炎抗原(HEVAg)-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒抗原能否在动物体内诱导产生免疫应答。制备HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原后,通过皮下、滴鼻、口服途径接种Balb/c小鼠,每隔4周加强免疫两次,HEVAg与铝盐佐剂(铝佐剂疫苗Al_2O_3-Ag)为对照组,一定时间内检测抗体及细胞因子的应答水平。结果HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫、细胞免疫。滴鼻、口服途径黏膜系统中诱导产生较高滴度的IgA抗体,ELISPOT结果显示鼻腔、唾液腺中IgA ASCs数量显著增加;皮下途径诱导产生较高滴度的IgG抗体;常规铝佐剂疫苗相比于HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导较强的IgG抗体水平,未诱导产生黏膜免疫应答;HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导产生较强细胞免疫应答,皮下接种途径IFN-γ、IL-4生成细胞数量显著高于其它免疫组。与铝佐剂疫苗相比,HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原能有效诱导产生系统免疫及黏膜免疫应答,显示HEVAg-PLGA有潜力成为备选HEV黏膜疫苗抗原,同时展示PLGA颗粒作为黏膜系统抗原递送载体及黏膜佐剂的优越性。     

佐剂CpG-ODN与重组HBsAg疫苗联合免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫应答研究

目的 以CpG-ODN为佐剂与重组HBsAg(rHBsAg)疫苗合用,研究其对乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠模型的免疫应答效果.方法 40只HBV Tg小鼠随机分为4组,每组小鼠分别注射rHBsAg疫苗(单用rHBsAg组)、rHBsAg疫苗+CpG-ODN(试验组)、rIFNα-2b(IFN组)、生理盐水(对照组).经多次免疫HBV转基因小鼠,于免疫前、后不同时间采血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、抗-HBs阳性率和HBV DNA的变化,检测肝组织中HBsAg的表达.检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素2(IL-2)、IL-12(p70)以及γ干扰素(IFN-γ)的含量,分别检测免疫小鼠的脾细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤功能并计算各组小鼠肝组织活性指数(HAI).结果 rHBsAg组和rHBsAg+CpG组在免疫小鼠后2周100%诱导抗-HBs;rHBsAg+CpG组能显著降低血清中的HBsAg量或使HBsAg转阴,rHBsAg+CpG组肝组织中HBsAg的表达量与血清中一样降低,并降低血清中HBV DNA的拷贝数.rHBsAg组的CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比,IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量以及淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应均明显高于对照组(P＜0.05).rHBsAg+CpG组与rHBsAg组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P＜0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.在rHBsAg+CpG组肝组织中出现大量淋巴细胞,肝脏的HAI在4个组中最高.结论 CpG-ODN作为佐剂可以增强重组HBsAg疫苗诱导HBV转基因小鼠产生抗病毒免疫应答,重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.