新型冠状病毒南非B.1.351变异株的分离与分子特征分析

2020年12月广州市第八人民医院收治了 1例南非输入性COVID-19病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例.本研究使用Vero-E6细胞,对该病例咽拭子样本进行病毒分离,逐日观察,咽拭子接种的细胞管3d开始出现细胞融合样细胞病变(Cytopathic effect,CPE),5d出现完全CPE后再进行第二代接种,2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性.第2代复传的SARS-CoV-2病毒株TCID50测定结果为5.5log TCID50/0.1mL～5.8log TCID50/0.1mL.对分离毒株经采用三代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果为与参考毒株Wuhan/Hu-1/2019相比共发生30个碱基的变异、18个氨基酸的突变和18个碱基的缺失,比对结果显示分离到的毒株为SARS-CoV-2南非B.1.351变异株.     

鼠脑微血管内皮细胞的分离与长期培养

采用胶原酶消化、差速离心、尼龙网滤过技术分离和获取鼠脑微血管内皮细胞,接种后4h换液使获得的内皮细胞纯化,体外进行长期培养。细胞在体外生长176天,传至30代,细胞初期成活率为92％,纯度近90％。经形态学、超微结构和免疫组化鉴定,培养细胞为血管内皮细胞。培养至第30代的细胞仍能合成和分泌PGI2、ACE等,ⅧF:Ag阳性表达,染色体为二倍体(2n=42),基本保持着细胞的主要特征。该分离和培养方法的建立,将为研究与脑血管相关疾病提供有用工具。     

COVID-19确诊病例居住环境病毒检测结果分析及防控探讨

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)传播速度快、感染范围广,其感染方式主要是聚集性感染,感染途径主要是呼吸道飞沫和接触传播。了解环境中,特别是COVID-19确诊病人生活环境中的病毒存在情况,是做好环境消毒,阻断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传播的重要步骤,对COVID-19防控具有重要意义。本研究旨在探讨COVID-19患者生活环境中SARS-CoV-2的存在情况,从SARS-CoV-2存在的空间部位、病毒核酸含量、消毒效果等方面对SARS-CoV-2的相关特点做出初步研究,为制定有效的SARS-CoV-2防控措施提供科学依据。本研究以COVID-19病例治疗前的3个家庭居住环境和治疗出院后隔离期间的2个宾馆居住环境中采集的样本为研究材料,采用RT-PCR方法检测样本中的SARS-CoV-2核酸并进行比较分析。结果显示,首次从3个家庭环境中采样48份,RTPCR检测SARS-CoV-2核酸阳性5份(10.42%),3个家庭的环境样本中均有阳性样本检出。首次采样48h后在家庭3进行第二次采样16份,SARS-CoV-2核酸检测阳性2份(12.5%),检测Ct值比首次升高。家庭3消毒后24h采集的16份样本SARS-CoV-2核酸检测均为阴性,并且两处宾馆环境采集的24份样本SARS-CoV-2核酸检测也均为阴性。本研究提示,COVID-19病例的生活环境中可以检出SARS-CoV-2,病毒存在区域、存在物品、病毒核酸含量均有差异;对外环境进行消毒可以达到消毒目的,能够起到阻断SARS-CoV-2传播的防控效果。     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变.从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株.对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙江省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近.     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变。从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株。对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙汀省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近。     

稳定表达貉犬瘟热病毒细胞受体SLAM的Vero细胞系的建立及应用

[目的]信号淋巴激活分子(SLAM又称CD150)为犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的细胞受体.本研究目的在于建立稳定表达犬瘟热易感动物貉SLAM基因的Vero细胞系,用于犬瘟热诊断及CDV强毒株的快速分离.[方法]从重组质粒pMD-18-T-rSLAM扩增rSLAM基因编码区,通过分子克隆技术构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-rSLAMhis.将该质粒转染Vero细胞后,经EGFP荧光观察、G418抗性压力和单细胞克隆化及RT-PCR筛选表达rSLAM阳性细胞系.应用获得细胞系对临床犬瘟热病例进行病毒分离,对分离得到CDV进行RT-PCR鉴定及动物回归试验.[结果]经过RT-PCR和免疫组化试验证实,本实验筛选获得一株能稳定表达rSLAM的Vero细胞系——Vero-rSLAM.该细胞系接种CDV阳性样品36-48h即可产生典型CDV致细胞融合病变,而其亲本Vero细胞接种至6d均无可见细胞病变出现.应用Vero-rSLAM细胞系从狐狸、貉犬瘟热阳性病料中分离获得了3株犬瘟热病毒.其中犬瘟热病毒LN(10) f1株对易感狐狸、貉均可产生致死性感染.[结论]成功建立了稳定表达rSLAM的Vero细胞系,用它分离的CDV对本动物保持较强的毒力.     

胶体金免疫层析法检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的临床评价与应用

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染暴发流行已成为全球公共卫生事件,急需快速有效的现场诊断试剂。为探讨SARS-CoV-2病毒IgM/IgG抗体胶体金免疫层析法检测效果及临床应用价值,本研究选取304例新冠肺炎临床诊断病例、114例SARS-CoV-2核酸检测阴性的正常人(138)及其他发热伴呼吸道症状病例(64),采用胶体金法对采自上述病例的血浆或血清标本进行IgM和IgG抗体检测,并选取部分病例进行了全血和血浆或血清标本的检测同源性比较,进一步对304例临床诊断病例的病毒核酸、IgM/IgG抗体的时间分布进行了分析。结果显示,304临床诊断病例中,SARS-CoV-2核酸检测阳性病例为105例,胶体金法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体的敏感性分别为76.2%(80/105)和86.6%(91/105),IgM/IgG抗体阳性总体符合率为96.1%(101/105);核酸、抗体均为阴性者为73例;其余126例临床诊断病例中,IgM阳性率为69.2%(87/126),IgG阳性率为98.3%(125/126),IgM/IgG总体符合率为100%(126/126)。健康人和其他发热病人中,IgM和IgG检测特异性分别为99%(200/202)和98%(198/202)。同源全血与血浆或血清标本抗体检测结果的总符合率为99%,显示两者具有高度一致性。本研究提示,胶体金法检测SARS-CoV-2抗体有较好的敏感性及特异性,可用于临床辅助诊断和流行病学调查等,具有较广泛的应用场景,在新冠肺炎疫情防控中具有一定的应用价值。     

尿素解离法降低新型冠状病毒IgM和IgG检测结果假阳性的效果评价

探讨引起新型冠状病毒(SARS-CoV-2)免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体检测结果假阳性的干扰因素,改良检测方法,完善实验室检测方案。本研究收集2020年1月2日至2020年3月5日就诊于川北医学院附属医院及南充市中心医院的门诊及住院患者血清样本共74份,其中19例为SARS-CoV-2核酸检测确诊阳性,10例为其他呼吸道病毒IgM抗体阳性,10例肝炎病毒抗体IgM阳性,20例类风湿因子IgM阳性,15例抗核抗体阳性。采用胶体金免疫层析法(试剂A、试剂B)分别对研究对象血清进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测,并对结果为SARS-CoV-2 IgM或SARS-CoV-2 IgG阳性的病例进行分析,发现造成检测结果假阳性的可能因素。再采用合适浓度的尿素对检测为阳性结果的血清及3例SARS-CoV-2 IgM阳性的COVID-19早期患者血清进行解离,解离后分别重新测定SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体。采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学分析。结果显示,19例COVID-19确诊患者血清中,试剂A检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数为15例及18例,试剂B检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数均为12例;20例类风湿因子IgM阳性患者血清中,试剂A检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳性数为16例及14例;15例高滴度ANA阳性患者血清中,试剂B检出4例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性。尿素解离浓度为2 mol/L时,试剂A检出的RF-IgM阳性血清中的16例SARS-CoV-2 IgM抗体有14例转阴,14例SARS-CoV-2 IgG抗体有13例转阴,而试剂A在COVID-19确诊患者血清中检出的SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体均未出现阴转;尿素解离浓度为4 mol/L时,试剂B检出的ANA阳性血清中的4例SARS-CoV-2 IgG抗体全部转阴,而在COVID-19确诊患者血清中检出的的SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体均未出现阴转。另外,经过尿素解离后,试剂A和试剂B在3例COVID-19早期患者血清中检出的SARS-CoV-2 IgM抗体也都未出现阴转。本研究提示,IgM型类风湿因子易造成试剂A检测血清SARS-CoV-2 IgM、IgG结果的假阳性;高滴度的ANA抗体也会引起试剂B检测血清SARS-CoV-2 IgG结果的假阳性。对检测结果假阳性的样本,采取尿素解离方案,能有效降低检测过程中假阳性发生的概率;尿素解离法对COVID-19患者发病早期标本检测灵敏度的影响尚待进一步深入研究。     

北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型的分离及鉴定

了解北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)毒株特点,为猫疱疹病毒Ⅰ型的进一步研究及对猫的感染预防控制奠定基础。经特异性PCR检测为FHV-1阳性临床猫眼鼻拭子,经过处理,接种CRFK细胞,通过细胞培养分离病毒。通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察、病毒毒力测定及基因序列分析等对分离株进行鉴定。PCR检测FHV-1阳性的14只猫眼鼻拭子接种CRFK细胞,有6只猫样本能使CRFK细胞发生圆缩、拉网集聚等病变;6个样本接种的CRFK病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生绿色荧光反应;经传代培养,有5株分离株能够稳定传代,其中有2株弱毒,3株强毒;电镜下5株分离株均可见直径100~160nm的球型病毒粒子;5株分离株与FHV-1标准株C-27及2个不同公司来源疫苗株gB、gD基因核苷酸比较同源性均为99%以上。实验室成功分离保存5株能稳定传代的FHV-1毒株,5株分离株与FHV-1标准株及2个疫苗株亲缘关系很近。     

上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测分析及病毒分离

目的了解上海地区实验小鼠自然感染小鼠诺瓦克病毒(murine norovirus,MNV)的状况,并分离毒株。方法抽取委托检测单位送检的SPF小鼠319只,分别采集盲肠内容物及血液样本,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增小鼠盲肠内容物样本中MNV的特异性基因片段来检测MNV的感染情况,同时采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与核酸检测方法进行对比。将RT-PCR扩增结果为阳性的盲肠内容物样本稀释并经0.22μm滤膜过滤,接种到小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,盲传后采用RT-PCR方法鉴定。结果 RT-PCR检测的319份小鼠盲肠内容物样本中,阳性样本95份,阳性率为29.78%。对180份经RTPCR检测的小鼠血清进行ELISA检测,阳性样本70份,阳性率为38.89%。RAW 264.7细胞盲传5代后在72 h内出现细胞病变,经RT-PCR鉴定,显示187 bp的目的条带。结论通过核酸检测方法和血清学方法证实上海地区实验小鼠存在MNV自然感染,且感染率较高,应加强实验小鼠的饲养管理。     

新型冠状病毒肺炎感染病例中鼻咽拭子与咽拭子标本的病毒核酸检验结果分析

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要通过飞沫和密切接触传播,传染性强,目前在全球蔓延,给人的身体健康及世界公共卫生安全造成了严重的损害。病毒核酸检验是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例确诊的金标准。本研究分别采集武汉江夏方舱医院67例确诊为COVID-19病例的鼻咽拭子与咽拭子标本送检,进行SARS-CoV-2核酸检验。其中28例患者鼻咽拭子病毒核酸呈阳性,13例患者咽拭子病毒核酸呈阳性,26例患者鼻咽拭子与咽拭子病毒核酸均为阴性。本研究结果提示,鼻咽拭子送检标本病毒核酸检验结果优于咽拭子标本(P<0.05)。     

Vero及Vero-dst细胞对犬瘟热病毒敏感性比较

目的为了更好地分离犬瘟热病毒（CDV）并确诊犬瘟热,本实验比较了Vero及Vero-dst细胞对此病毒的敏感性。方法将CDV标准毒株Snyder Hill株及临床犬瘟热阳性犬组织匀浆分别接种Vero及Vero-dst两种细胞,通过观察细胞病变、检测病毒滴度（TCID50）,并通过RT-PCR法进行比较,分析两种细胞对CDV的敏感性。结果接种病毒后Vero细胞盲传5代始终未见细胞病变,而Vero-dst细胞12 h出现了明显的合胞样细胞病变,且RT-PCR扩增出了CDV基因特异性片段。结论 Vero-dst细胞对CDV表现了良好的敏感性,是体外分离培养CDV的一个有效细胞系。而所本实验中使用的Vero细胞并不适于CDV的分离与培养。另外,本实验利用Vero-dst细胞从临床犬瘟热阳性病例中成功分离到了野毒株,并确定其毒力较标准毒株毒力强,可用于进一步的研究。     

水痘-带状疱疹病毒分离和鉴定

本文报告了用7份水痘或带状疱疹病人的皮肤病变水泡液,在人胚肺二倍体细胞(2BS)中培养传代,分离到7株病毒分离物,第一株是由带状疱疹病例分离到的,经细胞病变、核内包涵体和电镜形态学观察,认为此分离物属于疱疹病毒科成员;经血清学鉴定,证实为水痘-带状疱疹病毒(VZV),其宿主范围与疱疹病毒(HSV)不同,余6株分离物经ELISA、IFA及CF血清学试验鉴定均为VZV。     

流行性感冒病毒细胞培养阳性相关影响因素分析

目的分析影响流行性感冒病毒(流感病毒)细胞培养阳性的相关因素。方法对2014年4月—2017年3月采集的流感样病例咽拭子标本进行PCR核酸检测,对检测阳性的样本进行细胞分离培养,以分离得到的阳性样本为病例组,阴性样本为对照组,进行对照分析研究,用Logistic回归对影响病毒分离阳性的因素进行分析。结果1 298份PCR核酸检测阳性样本中,分离阳性率为22.80%(296/1 298)。其中,季节性H3N2占13.79%(179/1 298),甲型流感病毒H1N1占1.54%(20/1 298),乙型流感病毒(Victoria)占7.24%(94/1 298),乙型流感病毒(Yamagata)占0.23%(3/1 298)。样本来源、发病采样时间间隔、原始样本PCR核酸检测结果、不同采样机构和采样至收样时间间隔对病毒分离结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论缩短收样至接种时间间隔以及提高医疗机构的采样水平是提高流感病毒分离阳性率的关键。     

细胞分离戊型肝炎病毒的初步研究

本文报告用2BS细胞分离戊型肝炎病毒(HEV)感染成功的猴肝脏标本中的HEV的初步结果,将2BS细胞长成致密单层,接种已知含有HEV的肝悬液,盲传至第4代,发现在第27天细胞出现了轻微的细胞病变(CPE),随着进一步的传代,细胞病变时间逐渐提前。至第7代时,在第17天就可见到CPE,CPE的主要特征是细胞间隙变宽,透明度降低和轻度细胞破坏,无大片细胞溶解和脱落现象。免疫电镜检查在第5代和第6代细胞培养液中见到很少的27—34nm的病毒颗粒。将第4代至第7代的细胞悬液20ml接种了3只恒河猴,有2只猴在24天和26天出现了典型的ALT升高,待这3只猴恢复正常后一年,再次接种以上细胞悬液20ml,3只猴全部发生了ALT升高,并在胆汁中检查到27—34nm的病毒颗粒,我们初步推测2BS适应的这株病毒很可能是戊型肝炎病毒。     

疫苗株病毒引起1例成人水痘的病原分离与鉴定

本文旨在探讨1例由疫苗株病毒引起成人水痘的病例,以提高对水痘疫苗二次传播的认识。从1名23岁女性水痘患者皮肤水疱中采集水疱液,接种至人胚胎成纤维细胞,3d后观察到细胞发生病变效应。用水痘-带状疱疹病毒gE`糖蛋白单克隆抗体间接免疫荧光法鉴定,结果阳性。测序分析显示,分离到的毒株其疫苗相关的单核苷酸多态性位点与Oka疫苗株一致,为疫苗株病毒。回顾性调查显示,患者没有水痘史和疫苗接种史,病毒可能来自1名与患者直接接触的接种疫苗后发生带状疱疹的儿童。     

支气管肺泡灌洗液G试验可有效诊断早产儿肺部侵袭性真菌感染

本研究试图通过测量血清与支气管肺泡灌洗液中1,3-β-D葡聚糖浓度,分析应用支气管肺泡灌洗液G试验作为早期诊断早产儿肺部侵袭性真菌感染的可行性。选取2014年2月至2016年9月经确诊为侵袭性真菌感染的早产患儿42例作为观察组,将同期生产于我院的健康早产儿61例作为对照组。在清晨时间采集观察组与对照组早产儿的静脉血与分支气管肺泡灌洗液,将静脉血离心取上层血清待用,比较血清与支气管肺泡灌洗液的G试验的表达情况、阳性率及灵敏性。观察组早产儿经测量后,支气管肺泡灌洗液以及血浆中的1,3-β-D葡聚糖水平与健康早产儿比较有差异,说明通过G实验检测1,3-β-D葡聚糖有诊断早产儿侵袭性真菌感染的价值;观察组早产儿的支气管肺泡灌洗液G试验阳性率为83.33%,血浆G试阳性率为64.29%,x~2值为3.941,p值为0.047;支气管肺泡灌洗液G试验灵敏度为89.47%,血浆G试验灵敏度为65.79%,二者x~2值为6.138,p值为0.013。本研究的结果认为支气管肺泡灌洗液G试验可以有效、敏感的测定早产儿体内1,3-β-D葡聚糖的表达情况,应用于早产儿早期诊断肺部侵袭性真菌感染具有临床价值。     

2020年湖北省襄阳市601份冷冻食品新冠肺炎病毒检测结果分析

自新冠疫情暴发以来,食品或其包装袋不断被检测出新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸阳性,均与冷冻生鲜相关。为评估SARS-CoV-2污染冷冻食品的风险,本研究采集湖北省襄阳市各大商超、批发市场和餐饮企业的601批次冷冻食品进行新型冠状病毒核酸检测,分析国内外不同品种和不同经营场所的冷冻食品的新型冠状病毒核酸检测结果。结果显示,该601批次的冷冻食品的新型冠状病毒核酸检测结果全部为阴性。本研究提示,襄阳市的冷冻食品被SARS-CoV-2污染的风险较低,其作为SARS-CoV-2传染源的可能性较小。     

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染病原研究

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染明显增多,出现两次流行高峰,患儿90％在6个月龄内,3月龄内占65％,临床主要表现为细支气管炎、肺炎。本报告是从门诊及住院117名患儿采集咽分泌物及血液标本,分别进行病毒分离及间接免疫酶组化染色检查,确定两次流行均主要由呼吸道合胞病毒(RSV)感染所致。117份咽分泌物标本,接种Hep—2细胞共分离出29株病毒(阳性率24.8％)。经中和试验鉴定为呼吸道合胞病毒24株(82.8％),3型腺病毒4株(13.8％),腮腺炎病毒1株(3.4％)。29株病毒中25株于接种标本后12天内即出现明显的特征性细胞病变(CPE),最短的仅4天。117例患儿血清标本,酶染色阳性为32侧(阳性率27.4％),与病毒分离比较,两者均阳性者22例,均阴性者83例,符合率89.7％,病毒分离阳性,酶染色阴性者2例(均为发病后第二天入院抽血患儿)。酶染色阳性,病毒分离阴性者10例,表明酶染色法敏感性明显高于病毒分离。     

丽水市早期新冠肺炎无症状感染者SARS-CoV-2全基因组序列分析

对1例新型冠状病毒肺炎疫情流行早期的无症状感染者临床标本进行SARS-CoV-2实验室鉴定和全基因组测定,在分子水平了解新型病毒的基因特点和变异情况,追溯病毒潜在来源.实时荧光定量PCR扩增丽水市庆元县首例确诊患者密切接触者的痰液标本SARS-CoV-2核酸,阳性RNA逆转录为cDNA构建文库后进行基于NGS的宏基因组深度测序,生物学软件分析处理数据.该密接无任何症状及体征,痰液标本SARS-CoV-2核酸阳性.测序数据包含有足够的病毒序列,组装成功后hCoV-19/Lishui/LS556/2020长29 887bp,G+C含量37.99％,在ORF1ab和N区域发现4个SNP,对应1个错义突变和3个同义突变.LS556与SARS-CoV-2参考序列核苷酸/氨基酸同源性在99.2％/97.4％以上,不同序列之间存在4～17个核苷酸差异,与蝙蝠病毒RaTG13核苷酸差异仅3.7％,存在1141个SNP,与穿山甲病毒Guangdong/1相似性90.9％.LS556属于β冠状病毒Lineage B谱系,与LS003和ZJU-06共享完全相同的病毒,与蝙蝠/穿山甲冠状病毒进化上最相关.结合流行病学、核酸诊断、病毒溯源判定其为无症状感染者.LS556组成和结构符合SARS-CoV-2典型的基因特征,为高覆盖率序列,在流行早期与其他SARS-CoV-2基因组具有高度的同一性,突变率保持在较低水平,多数导致氨基酸位点保守置换.