心肌微环境对诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的影响

目的:探讨体外心肌微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和心肌细胞并在体外培养纯化。以2×10~4/mL的细胞密度种植心肌细胞,培养72h后收集上清,在BMSCs的培养基内加入心肌细胞培养上清诱导BMSCs分化为心肌样细胞,实验共分6组:10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组及含10%胎牛血清的对照组,均诱导BMSCs7d,每天在倒置显微镜下观察细胞的形态变化;应用免疫细胞化学技术检测不同浓度心肌细胞培养上清组诱导7d后BMSCs中a-平滑肌肌动蛋白(a-sMA)、β-肌动蛋白(β-actin)、心肌特异性肌钙蛋白T(Troponin-T)、CD31以及FactorⅧ的表达。结果:心肌细胞培养上清组诱导BMSCs7d后,细胞的形态没有改变。10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组a-sMA、。-actin以及Troponin-T的表达均呈阳性,以30%心肌细胞培养上清组的蛋白表达量最高(P<0.01),而CD31和FactorⅧ的表达呈阴性。结论:心肌细胞的培养上清能够诱导BMSCs分化为心肌样细胞,且30%心肌细胞培养上清是诱导BMSCs向心肌样细胞分化的最适浓度。     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

MSCs在自组装多肽纳米纤维支架中的三维培养及脂向分化研究

拟采用自组装多肽RADA16水凝胶建市MSCs的三维培养体系,以观察MSCs在RADA16中的黏附、形态及脂向分化情况.将第3代细胞置于RADA16水凝胶中进行三维培养.实验组细胞-材料复合物以脂向诱导液诱导,对照组以DMEM培养液培养,然后进行形态学观察,油红O染色及Western blot检测.荧光染色显示,绝大多数MSCs在RADA16水凝胶中能存活,且在不同的三维平面上生长.经诱导后,细胞内有大量油红O染色阳性的脂滴聚集,Western blot分析结果显示有脂肪细胞特异的蛋白PPARγ表达,且表达量随诱导时间的延长而增加.以上结果表明,RADA16水凝胶支架为MSCs的黏附、生长提供良好的三维环境,经定向诱导后支架内的MSCs可向脂肪组织方向分化.     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

To investigate the potential of adult mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from human bone marrow to undergo cardiomyogenic differentiation after exposure of 5-azacytidine in vitro. A small bone marrow aspirate was taken from the iliac crest of human volunteers, and hMSCs were isolated by 1.073 g/mL Percoll and cultured in the right cell culturing medium as previously described. The phonotypes of hMSCs were identified by flow cytometry. The stem cells were cultured in cell culture medium (as control) and medium mixed with 5-azacytidine (5-aza, 3, 5, 10 micromol/L) (n=5, respectively) for cellular differentiation. We examined respectively with immunohischemistry at 21 days of inducement on desmin, cardiac-specific cardiac troponin I (cTnI), GATA4 & connexin43. The ultrastructures of induced cells were examined by transmission electron microscope. The results indicated that the hMSCs showed a fibroblast-like morphology with vortex distribution in their peak propagation, and express high level of CD44 but negative for CD34 and CD45. 20%-30% cells grown after 5, 10 microl/L 5-aza treatment connected with adjoining cells and coalesced into myotube structures after 14 days. After 21 days of culturing, immunohistochemistry revealed expression of desmin, GATA4, cTnI and connexin43 in 5, 10 micromol/L showed positive, but no cardiac specific protein were found in neither 3 micromol/L nor in control group. The ratio of cTnI positive stained cells in 10 micromol/L group were higher than that in 5 micromol/L group (65.3+/-4.7% vs 48.2+/-5.4%, p<0.05). Electron microscopy revealed myofilaments were formed. The results indicated that purified hMSCs from adult bone marrow can be differentiated into cardiac-like muscle cells with 5-aza inducement in vitro and the differentiation is in line with the 5-aza concentration.     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

为了探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及化学诱导向心肌细胞分化的过程及条件,我们用1.073g/mL密度梯度离心法分离健康人骨髓单个核细胞,经骨髓间充质干细胞培养基传代培养后用流式细胞仪检测细胞表面抗原,在完全培养基中分别加入3、5、10μmol/L的5氮胞苷(每组n=5)进行化学诱导分化,阴性对照组采用完全培养基培养,诱导后21天细胞爬片免疫荧光法鉴定,透射电镜观察细胞超微结构。结果显示人MSCs为形态均一的梭形细胞,生长旺盛时呈旋涡样分布,流式细胞仪检测细胞表面CD44阳性,CD34、CD45阴性;5、10μmol/L的5氮胞苷进行化学诱导后细胞形态变长,诱导后14天时20%-30%细胞融合形成多核肌管样结构,3μmol/L组MSCs未出现肌管结构,诱导后21天5、10μmol/L组MSCs中desmin、心肌早期转录因子GATA4、心肌特异性cTnI及闰盘蛋白connexin43的表达阳性,10μmol/L组cTnI阳性染色细胞数目(65.3±4.7%)高于5μmol/L诱导组(48.2±5.4%)(p<0.05);3μmol/L组及阴性对照组无心肌特异性蛋白的表达。细胞诱导后28天透射电镜下可见肌丝形成。本实验说明,人MSCs在体外经化学诱导可分化为心肌样细胞,而且5-氮胞苷对于心肌相关蛋白的表达呈浓度依赖性正相关。     

贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。研究MSCs的生物学特性,为血管组织工程提供理想的种子细胞。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSCs体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用MTT法测定MSCs的生长曲线;行免疫组化方法鉴定MSCs膜抗原;分别加成骨、成脂肪诱导剂后MSCs体外培养1到3周,分别做碱性磷酸酶(ALP)、VonKossa染色及油红O染色,观察细胞形态变化、成骨及成脂肪分化结果。结果MSCs体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,表达波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不表达层粘连蛋白(Laminin)、CD34、VIII因子相关抗原(VIII)。经体外诱导后具有多向分化潜能。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSCs,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,为其成为血管组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

无论是在体外实验、还是在体内实验,MSCs都可以向中枢神经系统(CNS)神经细胞分化,但争议颇多。因为功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记,还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等,所以对于骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。在此对MSCs向神经细胞诱导分化研究的现况、存在的问题及发展前景给以综述。     

生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcell,BMSC)是骨髓基质细胞的重要组成部分,由于其不但能与其他细胞一起支持造血干细胞造血,而且还具有较强的增殖功能及多向分化潜能,在一定诱导因素下可定向分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年来已成为生物学和医学的研究热点。本文简要介绍了不同生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等对BMSC增殖、分化的影响。     

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。     

骨髓间充质干细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体 ,具有支持造血、多向分化潜能以及在细胞和基因工程中具有潜在应用前景等特点 ,将在医学上具有重要的临床应用价值。     

影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素

长期的骨骼废用引起的骨质减少主要归因于骨形成的减少,成骨细胞由具有多向分化潜能的间充质细胞经骨原细胞、前成骨细胞分化而来,骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,本文综述了骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素,有助于增加对骨丢失的理解,并进行预防和治疗,为航天员和骨骼废用病人创造更健康的生活。     

富血小板纤维蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）对体外培养的兔骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）成软骨分化的影响。方法：兔心脏采血制备PRF,电镜观察其超微结构;分离培养兔BMSCs,取第3代细胞用于实验．分为PIuF组、阳性对照组、空白对照组。诱导培养21d后,对三组细胞分别进行形态学观察,成软骨鉴定染色（甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色）,软骨相关基因表达检测（Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9）。结果：PRF组和阳性对照组中BMSCs经诱导后,细胞由长梭形变为三角形、多角形、圆形;甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9基因表达水平均较高,两组比较无统计学差异,空白对照组未见相关分化现象。结论：PRF在体外可促进兔BMSCs成软骨分化,可作为自体生物材料,在构建组织工程软骨中发挥更好的作用。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,为下一步实验研究奠定基础.方法:采用密度梯度离心法获得骨髓单核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样细胞.免疫荧光及PCR检测细胞表面标志及多能性基因的表达,并鉴定分离细胞的多向诱导分化潜能.结果:体外培养的原代细胞10天达到融合,传代后仍具有成纤维样的形态;免疫荧光结果见波形蛋白(Vimention)和Oct4标记阳性,CD45阴性;PCR分子检测见多能性基因OCT-4,nanog的表达;细胞具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力.结论:采用密度梯度离心法获得的pMSCs体外增殖能力强,纯度高,具有间充质干细胞的特性,pMSCs分离培养体系的成功建立为下一步实验研究奠定基础.     

去甲肾上腺素对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:观察去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响及其作用途径.方法:分离培养正常大鼠BMSCs,采用3H-TdR掺入实验检测不同浓度的NE(10-7-10-4 M)作用8h及10-5M的NE作用不同时间(0-24h)BMSCs细胞增殖情况,real time RT-PCR检测肾上腺素能受体α1A-AR,α1B-AR和α1D-AR mRNA表达变化情况.结果:10-7-10-4M的NE作用8h后均促进了BMSCs细胞的增殖.并且在10-5M时NE对BMSCs的促增殖效应最为显著;正常组BMSCs细胞的α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR mRNA表达维持在较低水平,加入10-5M的NE作用后α1-AR三个亚型mRNA表达水平均有不同程度的升高(P<0.05).结论:NE能够促进BMSCs的增殖,并且这种促增殖作用是通过AR依赖的信号通路来调节的.     

Myogenic Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Fetal Bovine Bone Marrow

The myogenic potential of bovine fetal MSC (bfMSC) derived from bone marrow (BM) remains unknown; despite its potential application for the study of myogenesis and its implications for livestock production. In the present study, three protocols for in vitro myogenic differentiation of bfMSC based on the use of DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza), myoblast-secreted factor Galectin-1 (Gal-1), and myoblast culture medium SkGM-2 BulletKit were used. Plastic-adherent bfMSC were isolated from fetal BM collected from abattoir-derived fetuses. Post-thaw viability analyses detected 85.6% bfMSC negative for propidium iodine (PI). Levels of muscle regulatory factors (MRF) MYF5, MYF6, MYOD, and DES mRNA were higher (P?MYOD mRNA (Days 7 to 21) and up-regulation of MYF6 (Day 7), MYF5, and DES mRNA (Day 21). Gal-1 and SkGM-2 BulletKit induced sequential down-regulation of early MRF (MYF5) and up-regulation of intermediate (MYOD) and late MRF (DES) mRNA. Moreover, DES and MYF5 were immunodetected in differentiated bfMSC. In conclusion, protocols evaluated in bfMSC induced progress into myogenic differentiation until certain extent evidenced by changes in MRF gene expression.     

中老年人骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的:研究中老年人骨髓间质干细胞(MSCs)的生物学特性。方法:用Ficoll-Paque分离不同年龄段供者MSCs体外培养,进行诱导分化,用流式细胞术检测表面标志,核型分析观察细胞染色体的稳定性,裸鼠实验、软琼脂实验观察致瘤性。结果:中老年人每毫升骨髓分离的单个核细胞量和MSCs增殖速度与青年人无显著差异;中老年人不同代次的MSCs诱导后具有向成骨细胞和成脂细胞分化的能力;分离培养的MSCs表达CD44,不表达CD34;传至第10代核型未见异常,未见致瘤性。结论:中老年人MSCs有较强的体外增殖能力和多向分化潜能,遗传背景稳定。     

Wnt 信号通路与骨髓间充质干细胞成骨之间的关系

Wnt信号通路是由Wnts诱发的一系列相互作用的分子组成。Wnt信号对骨髓间充质干细胞的影响在所有研究中均证实有明显作用,其可调节干细胞增殖、分化及凋亡。研究表明,抑制Wnt信号通路转导可使成骨细胞分化进程受阻,从而抑制骨形成;若诱导Wnt家族成员表达则可使成骨细胞特异性基因表达增加,促进骨形成。本文就Wnt信号通路的作用过程及其与骨髓间充质干细胞成骨诱导的关系做一综述。     

人骨髓间充质干细胞培养方法

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一种多潜能的成体干细胞,在细胞治疗和组织工程上具有广阔的应用前景。对供体年龄、分离方法、培养密度、培养基和培养基质表面性质对细胞增殖的影响进行了比较,重点阐述了用人自体血清结合多种细胞因子,替代胎牛血清培养BMMSCs的效果,转染端粒酶基因的BMMSCs的增殖能力和分化潜能,以及灌注培养反应器用于大规模培养的技术进展。     

M-CSF诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的分子机制

本研究主要目的是明确M-CSF诱导骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的分子机制,为临床中的肝移植和治疗肝病提供新思路。对取自于本院骨科治疗的患者的股骨骨髓间充质干细胞进行提取、分离、传代培养及鉴定。流式细胞仪检测BMSCs的表面表型。为了诱导BMSCs的肝分化,本研究将BMSCs加入到培养基中。骨髓间充质干细胞诱导21 d后,BMSCs表达了肝细胞特异性标志物a-蛋白(AFP)和细胞角蛋白18(CK18),通过免疫荧光染色证实了分化与为分化的BMSCs表达的差异性。分化的BMSCs还显示了肝细胞的体外功能特征,包括白蛋白产生、尿素分泌和糖原储存。本研究结果表明,BMSCs在M-CSF诱导下可分化为功能性肝细胞样细胞,可作为肝病治疗的细胞来源。