实时细胞监测技术的人肠道病毒71型感染性检测方法研究

开展基于微电子传感器技术的实时细胞监测技术(Real-time Cell Assay,RTCA)在人肠道病毒71型(HEV71)病毒诱导的细胞病变检测方法中的应用价值研究。动态观察RD细胞不同阶段的生长指数,选择合适的细胞浓度开展HEV71病毒感染力和血清中HEV71中和抗体效价测定。同时应用传统的微量试验作为方法学的比较和结果验证。细胞阻抗通过软件转换成细胞指数CI值和可视的动态变化曲线显示,在96电子孔板上,当RD细胞浓度为1.5×104个/孔时能满足HEV71病毒感染性检测的观察天数大于5d的要求。与传统显微镜观察细胞CPE的方法比较,两种方法在接种病毒后的132h(约5.5d)产生病毒致细胞病变的终点判断结果一致。在中和抗体试验中,三份感染HEV71病毒的人血清中和抗体效价CI值结果和传统的96孔微量板镜检法结果相符。实时细胞监测技术可以提示研究者,即使是终点判断结果为相同的中和抗体滴度的血清,其所含病毒诱导的细胞病变出现时间也可能有所不同。实时细胞监测技术用于HEV71病毒感染力和血清中和抗体效价检测与传统的微量板法检测相比可以节省劳力,消除人为判断的误差,可以作为传统检测方法的补充手段之一,也可以动态观察细胞病变的发生和发展,为进一步深入研究病毒感染力强弱或血清抗体消长提供更为科学的数据。     

建立以EGFP为报告基因检测HSV感染的细胞株

通过PCR扩增HSV-1ICP6启动子目的基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-1构建重组质粒pICP6-EGFP,转染Vero细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株Vero-ICP6-EGFP细胞。以不同量的HSV-1感染Vero-ICP6-EGFP细胞,分别以倒置荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP荧光的量和强度。结果表明,转染细胞株Vero-ICP6-EGFP感染HSV-16h后,倒置荧光显微镜下即可检测绿色荧光;流式细胞术检测结果表明,EGFP荧光的量及强度随HSV-1病毒的滴度增加而增加。已建立的以EGFP为报告基因的Vero-ICP6-EGFP细胞株具有早期、快速、灵敏等优点,特异性较高,可望用于HSV感染的快速诊断及抗病毒药物的检测。     

检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法

建立了检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法。小牛血清与胎牛血清的培养效果无差异。7株不同来源的出血热病毒均能在E6细胞上形成空斑。接种的病毒浓度与形成的空斑数呈直线关系。用空斑法测得的病毒滴度稍低于荧光TCIE50滴定法。空斑减少中和试验的敏感性较荧光中和试验高30倍左右。同时还初步表明了本方法可用于流行性出血热病毒的抗原性分析。     

柯萨奇病毒A组4型生物化学特性及免疫原性分析

对引起手足口病的肠道病毒A组4型进行生物化学特性及免疫原性的研究。利用大肠杆菌表达结构蛋白全长或部分片段的GST融合蛋白,纯化CV-A4病毒颗粒,制备兔抗CV-A4 VP1～VP4蛋白及抗CV-A4病毒颗粒抗血清。以免疫印迹法（Western blotting,WB）,结合SDS-PAGE电泳法,对CsCl密度梯度纯化的CV-A4的空心颗粒（EP）与实心颗粒（FP）的蛋白组分、纯度、多聚蛋白酶剪切进行分析。以微量中和法测定以上6种抗原免疫的兔或小鼠血清中和抗体效价,评估免疫原性。WB和间接免疫荧光法证明了抗体特异性。EP由VP0、VP1和VP3构成,而FP的VP0被剪切,故由VP1-VP4构成。EP和FP比例分别为41%和59%。CsCl密度分别为1.26 g/cm3和1.34 g/cm3,纯度分别为70.5%和96.3%。中和试验显示,兔抗全病毒抗体具有中和作用,而兔抗CV-A4VP1～VP4结构蛋白抗体不具有中和作用。免疫原性强弱为：FP>EP>VP1-VP4。本研究建立了CV-A4纯化病毒结构蛋白的分析方法,研究了重组病毒蛋白及2种病毒颗粒的免疫原性及免疫持久性。对包...     

HPV16/18假病毒中和抗体检测方法的验证

目的应用假病毒中和法建立检测血清HPV16/18中和抗体滴度检测方法并进行验证。方法分别采用不同批次假病毒以及不同代次细胞对不同滴度的HPV16/18阳性血清进行多次平行检测,考察这些因素对检验结果的影响;同时通过对抗HPV16/18双价阳性血清、抗HPV16单价阳性血清和抗HPV18单价阳性血清的检测进一步评估中和抗体检测法的准确性、特异性及重复性。结果不同批次假病毒和不同代次细胞对检验结果的影响均在4倍范围内,此外该检测法的准确性、特异性、重复性均在可接受标准范围之内。结论建立的假病毒法可满足中和抗体效价检测的要求,可用于评价疫苗的免疫效果。     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

目的:对人免疫球蛋白和肠道病毒71型和抗体效价进行测定。方法:采用微量细胞病变法,以试验和毒株-01、毒株-02进行检测,对比三种试验检测结果的差异。结果:检测人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价范围在105~256之间,效价≥239为12批,占总批数的40%,效价≥256为10批,占总批数的33.3%;毒株-01检测效价范围约为224~476,平均滴度为334。3批静注肠道病毒71型平均滴度为1400,高于3个厂家10批人免疫球蛋白含量,(P<0.05)。毒株-02检测效价范围在195~620之间,平均滴度为330,与毒株-01的检测结果差异不明显,不具有统计学意义(P>0.05)。毒株-01和毒株-02检测的17批人免疫球蛋白的肠道病毒71型中和抗体平均滴度为333,效价≥256,可应用于临床重症治疗。结论:经检测,我国各厂家中的人免疫球蛋白中的肠道病毒71型中核抗体效价均为阳性,静注肠道病毒71型免疫球蛋白高于普通人免疫球蛋白的中和效价。     

发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体酶联免疫吸附试验方法的建立及应用

本文旨在对发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)患者中和抗体进行定性和效价评估,建立中和抗体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。用96孔微量培养板培养非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)并接种发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),以抗核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)单克隆抗体为一抗,使用间接ELISA检测SFTSV NP,根据光密度(optical density,OD)判断阳性孔数,采用ReedMuench方法计算病毒半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50)),以反映SFTSV在Vero-E6细胞中的复制水平。ELISA检测中和抗体作用后的病毒残余量,可间接反映中和抗体的作用效果并进行定量。应用以上建立的微量中和-ELISA对10例SFTS患者的双份血清进行中和抗体效价测定,8例患者恢复期血清效价较急性期增高4倍以上,7份患者恢复期血清效价达1∶1 280,急性期血清效价最高为1∶640。结果提示,本研究建立的ELISA操作简便,结果判定客观,所需时间短,可用于临床血清抗体诊断,也可用于血清流行病学调查和疫苗效果临床评价等。     

三株柯萨奇A10型候选疫苗株生物学特性及免疫原性研究

近年来CV-A10已成为手足口病的最主要的病原体之一。本研究对3株不同CV-A10毒株进行生物学特性及体液免疫原性比较分析，筛选最适的CV-A10灭活疫苗候选株。将2014年荆州（JZ）分离株CV-A10-L12、2019江苏沛县（PX）分离株CV-A10-195和CV-A10-300，作为候选疫苗株经10层Vero细胞工厂培养，蔗糖垫底离心、蔗糖梯度离心、氯化铯等密度梯度离心后收获病毒颗粒。对不同候选毒株的滴度、病毒实心颗粒（FP）和空心颗粒（EP）的产量和比例、氯化铯密度、形态及结构蛋白等生物学特性进行比较分析。将纯化后病毒颗粒经甲醛灭活后，免疫Balb/C小鼠评价免疫原性。三株CV-A10候选疫苗株细胞工厂培养、纯化后，收获了高纯度、含病毒结构蛋白、形态完整的EP、FP颗粒。按照细胞培养自然EP和FP比例混合后，免疫6周龄Balb/C小鼠。以同源和非同源的四株CV-A10毒株作为中和毒种，测血清中和抗体滴度，评价3个疫苗候选株的体液免疫原性。CV-A10-195/PX/2019株病毒颗粒产量及免疫原性高于CV-A10-300/PX/2019株，高于CV-A10-L12/JZ/20...     

CV-A16感染沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化分析

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是导致手足口病的病原体之一,CV-A16感染后宿主的外周血细胞的细胞因子表达变化的报道较少,也未见有关血清中细胞因子含量在感染前后的表达变化。为了分析CV-A16感染的不同严重程度的沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化。通过腹腔注射CV-A16构建CV-A16感染发病模型,应用流式细胞术、实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测病毒载量、血清炎症因子和趋化因子水平动态变化。CV-A16感染后重症沙鼠的临床症状,包括体重下降程度、临床症状分值以及死亡率均显著高于轻症沙鼠,并且重症沙鼠外周血白细胞比例和升高趋势总体上高于轻症感染沙鼠;重症感染沙鼠全血中细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录水平上调,IL-4、IL-10、IL-8和IP-10的mRNA转录水平下调;并且CV-A16感染后重症沙鼠血清中的TNF-α和IFN-γ含量显著上升,IL-8和IP-10的含量显著下降。结论为重症沙鼠全血和血清中存在多种趋化和炎症因子上调,可能与Th1炎症失调有关。     

中国新疆维吾尔自治区不明原因发热人群中Tahyna病毒感染状况调查

本研究通过对新疆地区不明原因发热人群血清Tahyna病毒抗体进行检测,以了解Tahyna病毒在当地的感染状况及分布特征。通过间接免疫荧光方法对新疆维吾尔自治区南部喀什地区、北部伊犁地区742例不明原因发热患者急性期血清标本进行Tahyna病毒抗体检测,并对IgM抗体阳性标本平行进行Tahyna病毒、Snowshoe hare病毒和Inkoo病毒三种抗原性相似的布尼亚病毒的蚀斑减少中和试验。研究结果显示新疆南部喀什地区采集不明原因发热患者急性期血清中,IgM抗体阳性率5.3%,IgG抗体阳性率18.3%;新疆北部伊犁地区采集的急性期患者血清标本中并未发现TAHV IgM抗体阳性;蚀斑减少中和试验结果显示,TAHV IgM抗体阳性患者血清中Tahyna病毒中和抗体滴度较其它两种布尼亚病毒中和抗体滴度升高明显。本研究证实新疆南部地区不明原因发热人群存在Tahyna病毒的急性感染和既往感染,为相关疾病的进一步监测提供基础。     

柯萨奇病毒A组16型灭活抗原对小鼠免疫保护作用的研究

为了研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)灭活抗原在小鼠体内所产生免疫保护作用效果,我们选用CVA16临床分离株521-01T,在Vero细胞中进行大量培养,并对培养产物进行甲醛灭活及超速离心纯化。SDS-PAGE和Western blot对纯化的灭活病毒纯度及性质进行初步分析。Al(OH)3+CVA16及单独CVA16抗原,分别经皮下注射免疫雌性ICR小鼠;相同免疫途径、剂量于第14和28d加强免疫2次。ELISA法检测CVA16特异性血清IgG抗体滴度;微量中和试验法鉴定血清中和抗体滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化。对Al(OH)3+CVA16抗原免疫组母鼠所产仔鼠进行脑腔攻毒,检测母传抗体对新生乳鼠的保护作用。结果显示,Al(OH)3+CVA16灭活抗原在小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,3次免疫后产生的特异性血清IgG抗体滴度最高可达1∶1×105(P=0.000),中和滴度高于1∶256。同时,该抗原还可以诱导特异性T淋巴细胞的活化。以1 000LD50的病毒量脑腔接种48h内新生乳鼠的病毒攻击实验显示,该母传抗体对新生乳鼠具有100%的保护。这一结果表明该灭活CVA16病毒抗原具有较好的免疫原性及保护性,为CVA16灭活疫苗的研究及评价体系提供了参考。     

H7N9灭活疫苗联合MF59佐剂在小鼠体内诱导的长效体液免疫应答

以BALB/c小鼠为模型,探讨H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠后所诱导的长效体液免疫应答的动态变化。不同剂量的流感H7N9全病毒灭活疫苗单独或辅以MF59佐剂肌肉注射免疫小鼠一次。连续采集免疫后小鼠15个月的血清,用ELISA方法检测特异性IgG抗体水平,血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和微量中和(microneutralization,MN)试验检测第15个月时的HI抗体和中和抗体效价。实验结果发现,小鼠血清中的特异性IgG抗体水平随时间变化持续缓慢上升,第5个月时达到顶峰,随后略有下降但一直持续平稳状态;IgG抗体滴度与疫苗剂量成正相关,且添加佐剂能提高抗体滴度。HI及MN抗体检测表明,免疫后第15个月产生的抗体能有效中和病毒,且抗体跟疫苗剂量成正比。以上研究表明,H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠一次诱导产生的特异性抗体能在较长期内保持比较平稳的抗体滴度,为小鼠提供免疫保护;增加抗原剂量和添加MF59佐剂能增加疫苗特异性抗体水平。该研究为H7N9流感疫苗产生的长期保护效应提供了一定的数据积累和参考。     

稳定表达可视化hFcRn的MDCK细胞株构建

[目的]建立稳定表达融合EGFP的人新生儿Fc受体(h FcRn)的MDCK细胞株。[方法]构建重组慢病毒质粒p EGFP-h FcRn,采用四质粒包装系统共转染HEK 293T细胞生产重组慢病毒,感染MDCK细胞后对EGFP阳性细胞进行流式单细胞分选;通过Western Blot及EGFP-β2m荧光共定位验证h FcRn的完整性,并用流式细胞仪检测h FcRn与人Ig G的结合活性。[结果]测序结果表明成功构建p EGFP-FcRn慢病毒表达载体;感染后EGFP阳性MDCK细胞比例约为26.5%,流式单细胞分选后得到纯阳性细胞;荧光共定位及Western Blot均检测到h FcRn的完整表达;流式分析表明细胞株上的h FcRn与Ig G存在p H依赖性结合。[结论]成功获得稳定表达具有生物活性的可视化h FcRn的MDCK细胞株。     

应用免疫粘附血凝技术检测流行性出血热病毒抗原和抗体的试验研究

本文对免疫粘附血凝(IAHA)技术进行了改进并用于检测流行性出血热病毒搞原和血清效价。比较了不同毒株在Vero-E_6细胞内抗原滴度,表明A_9株的滴度最高达1:64,以IAHA法对出血热病人9份血清,3份恢复期血清和家兔免疫血清6份进行了效价测定。并同时用免疫荧光(IFA)法进行比较,结果抗体阳性率二种方法一致,但前者的抗体滴度和增长倍数较后者高2-64倍,以上结果表明IAHA法可代替IFA法用于出血热病人或感染动物的抗体检测。     

表达HPV16 L1抗原的1型重组AAV载体免疫效果的研究

为研究1型重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus type 1,AAV1)载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建含密码子优化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)的1型重组AAV载体rAAV1-mod.HPV16L1,将纯化的rAAV1-mod.HPV16L1以肌注和滴鼻途径分别免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测血清中的特异性中和抗体.结果显示,rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注及滴鼻免疫均可诱导特异性血清中和抗体,但二组抗体动态变化趋势不同,肌注组血清中和抗体滴度显著高于滴鼻组.rAAV1-mod.HPV16L1单针肌注免疫可诱导强而持久的血清中和抗体,是理想的候选HPV16预防性疫苗.     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性研究

目的 评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性。方法 制备含MF59佐剂的H7N9禽流感病毒裂解疫苗成品,放置于(6±2)℃环境下,取保存6、24和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,以血凝抑制效价和微量中和抗体滴度来评估该疫苗的免疫原性。同时,用存放30个月的疫苗进行2次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。结果 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(6±2)℃保存30个月后免疫小鼠,检测其血凝抑制抗体效价和微量中和抗体滴度均没有明显的变化,且免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的免疫原性,在(6±2)℃至少可保存30个月。     

Beagle犬免疫血清犬瘟热抗体检测

采用琼脂扩散法测定血清抗体效价,同时采用微量细胞中和实验测定中和效价,检测60份Beagle犬免疫血清犬瘟热(CD)抗体.结果表明25日龄仔犬血清母源抗体维持在较高的水平,以后逐渐下降,至35日龄(首免日)血清母源抗体水平下降1～2个滴度,首免后1个月、3个月、6个月免疫抗体水平逐渐上升.根据抗体水平应选择35日龄首免.本试验为 Beagle犬瘟热病预防选择疫苗和制定合适的免疫程序提供参考,实验设定的两种免疫程序在临床上都可以使用.     

利用报告基因的人7型腺病毒中和抗体检测方法的建立

目的:构建表达萤光素酶报告基因的重组人7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒,用于检测人群中HAdV7的中和抗体水平。方法:利用同源重组方法构建E1区和E3区部分缺失,并在E1区嵌入萤光素酶基因表达框的pAd7-Luc重组质粒,转染HEK-293细胞,包装出能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7载体重组病毒(Ad7-Luc);选取HAdV7阳性血清样本对新建立的报告基因检测方法的准确性和稳定性进行验证;最后,利用该方法对北京地区60份血清样本进行HAdV7中和抗体检测。结果:获得能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7-Luc重组病毒,病毒滴度可达4.85×10~8IFU/mL,Ad7-Luc检测法与传统细胞病变效应(CPE)法具有很好的一致性(R~2=0.8612,P0.0001),批内和批间差异分别在10%和20%以内。北京地区60例血清样本的检测结果显示,HAdV7血清阳性率约为60%(36/60),明显低于HAdV5血清阳性率75%(45/60),75%的HAdV7阳性血清中和抗体滴度集中于低滴度水平(12～200)。结论:与传统的细胞病变方法相比,HAdV7中和抗体报告基因检测方法更快速、灵敏、准确,适用于人群中HAdV7血清流行病学调查及其疫苗的中和抗体研究。     

戊型肝炎病毒高通量中和效价评价模型的建立

广泛有效的体外感染模型的缺乏限制了抗戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体及血清定量化中和效价的评估,从而阻碍了对HEV相关抗体应答及免疫机制的深入研究。本研究首先通过在HEV低效复制细胞系HepG2肝癌细胞株上进行了HEV感染细胞后的连续监测,直到第13d到达病毒载量的检测下限,验证了该细胞系建立感染模型的可行性,进一步采用96孔多通道平行感染、核酸提取及实时荧光定量PCR对五株抗HEV的鼠源单克隆抗体及四位戊肝疫苗接种者的接种前、后血清样本进行了细胞中和试验。结果显示应用该模型能够实现对不同中和能力的单抗及接种疫苗前后的血清进行中和效价的定量化评估。表明本研究已成功建立了HEV体外高通量中和评价模型,同时也显示出该模型在HEV疫苗及抗体应答表位研究中所具有的潜在价值。