人呼吸道禽流感病毒受体的分布趋势

禽类流感病毒和人类流感病毒具有很强的受体识别特异性,分别与唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体分子结合而感染各自的宿主细胞．这种受体结合特异性是流感病毒在禽类和人类之间跨种属传递的主要障碍．应用凝集素组织化学染色技术,探讨人呼吸道各解剖学部位流感病毒唾液酸受体的分布特征．结果显示,唾液酸α-2,3Gal受体, 即禽类流感受体,主要分布在下呼吸道的呼吸部即呼吸细支气管和肺泡, 而在主气管、支气管和细支气管仅少量分布．相反,人类流感病毒受体,唾液酸α-2,6Gal受体在气管、支气管呈高密度分布,随着支气管分级逐渐降低分布减少,至肺泡分布最少．但比较人呼吸道发育成熟过程中,唾液酸α-2,3Gal和α-2,6Gal受体的表达,未发现明显差别．禽流感H5N1病毒体外感染人呼吸道组织试验结果表明,肺泡上皮较支气管和气管上皮易感染,与唾液酸α-2,3Gal受体分布特点相符合．结果提示,人呼吸道可被禽流感病毒感染,目前H5N1病毒极少发生人传人的特点,可能与个体间上呼吸道唾液酸α-2,3Gal受体表达差异有关．     

H7N9感染与神经细胞的血小板活化因子分泌浓度的相关性研究

H7N9病毒感染除引起患者呼吸道症状外,还可能导致中枢神级系统病症。血小板活化因子(Platelet activating factor,PAF)是一种生物活性磷脂,参与神经系统的部分功能。但尚未有研究讨论PAF是否参与H7N9病毒中枢神经系统疾病致病机制。本研究通过H7N9病毒体外感染小鼠小胶质细胞(BV2)和神经母瘤细胞(N2a)发现,H7N9流感病毒可以感染BV2、N2a细胞,引起细胞明显病变并使细胞活性下降;此外H7N9病毒感染BV2细胞后,PAF浓度水平明显上升,PAF乙酰水解酶(Platelet activating factor acetylhydrolase,PAF-AH)基因pafah1b1和pafah2表达水平明显下降。而N2a细胞染毒后PAF-AH基因表达水平明显上升,染毒48h后胞内PAF浓度明显下降。本研究首次将PAF与流感病毒性脑病联系在一起,提示PAF可能参与流感病毒性脑病的致病过程,可作为治疗的药物靶点进行后续研究。     

唾液酸受体并非流感病毒各亚型在雪貂组织中播散分布的决定因子

目的探讨流感病毒在雪貂组织中的分布与唾液酸受体的关系。方法用病毒分离的方法分析流感病毒H5N1（SZ406H,A/VN/1203/04）,SH1N1,H3N2（Brisbane/09,HK/09）在雪貂各组织中分布,用直接免疫荧光法分析雪貂各组织的唾液酸受体的分布,并通过体外实验证实活病毒与组织上受体的结合。结果 H5N1（SZ）和H5N1（A/VN/1203/04）在雪貂的肝、脾、肺、肠中有分布,H5N1（A/VN/1203/04）在脑组织中也有分布,而SH1N1、H3N2（Brisbane/09,HK/09）只分布于肠组织。而唾液酸受体SAα2,6Gal和SAα2,3Gal的I型受体分布于脾、心、肺、肠、脑组织中,和SAα2,3Gal II型受体分布于肝、脾、心、肺、肠、脑组织。SH1N1病毒与SAα2,6Gal能结合,而H5N1与SAα2,3Gal结合。结论 H5N1能在雪貂的多器官组织组织中分布和繁殖,而H3N2和SH1N1仅能在肠组织中分布繁殖。SAα2,6Gal和SAα2,3Gal受体在雪貂多器官组织中均有表达,说明唾液酸受体是病毒进入的门户,但不是病毒分布的决定因子。     

H7N9流感病毒感染A549细胞蛋白质组学的初步研究

通过建立H7N9和H1N1流感病毒(H1N1pdm09)感染人肺癌上皮细胞(A549)模型,研究病毒感染细胞后细胞蛋白质组学差异变化,探讨H7N9流感病毒感染人类致病机制。将感染复数(MOI)为0.001的H7N9、H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h后提取细胞总蛋白进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定差异蛋白。质谱共鉴定出H7N9和H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h上调或下调的差异蛋白分别为11、12、33个。对差异蛋白进行功能分析发现与H1N1pdm09感染组相比,(纤)丝状肌动蛋白成帽蛋白α1(F-actin-capping protein subunit alpha-1,CapZ-α1)、鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)、Poly(rC)-binding protein 1(PCBP1)、真核翻译起始因子5A-1(Eukaryotic translation initiation factor 5A-1,eIF5A)在H7N9感染A549细胞后表达量的下调加速了致细胞病变效应。血小板活化因子乙酰水解酶Ⅰb亚基β(Platelet-activating factor acetylhydrolaseIb subunit beta,PAFAH1B2)在H7N9感染A549细胞后期表达量显著降低可能与该病毒感染患者的临床症状相关。     

甲型H1N1流感病毒感染小鼠的发病机制

目的甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009感染BALB/c小鼠,研究甲型H1N1流感病毒病毒性肺炎发病机制。方法 4～6周龄雌性BALB/c小鼠60只,随机分为2组,实验组和对照组,每组30只。CA7流感病毒滴鼻制备甲流病毒感染小鼠模型。攻毒后第5天解剖实验和对照组小鼠,取肺组织,测定肺组织中IL-2,IL-6,TNF-α含量。结果结果实验组肺组织中IL-6,TNF-α,水平明显高于对照组,IL-2水平明显低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05）。结论 IL-6、TNF-α、IL-2这3种细胞因子在感染甲流病毒后的显著性变化与病毒感染后的肺组织病理损伤有密切的关系。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9H1N1H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1H1N1H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9H1N1H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

JNK/MAPK通路与H7N9禽流感病毒感染小鼠模型肺损伤的关系研究

H7N9流感病毒感染呼吸道的能力强,感染后的病死率较高。流感病毒感染的肺组织可发生明显的炎症反应、氧化应激反应及细胞凋亡,进而出现肺损伤。c-Jun-N端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)/丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是细胞内调节凋亡、炎症的重要通路,该通路在H7N9流感病毒感染后肺损伤中的作用仍有待阐明。为了研究JNK/MAPK通路与H7N9禽流感病毒感染小鼠模型肺损伤的关系,本研究将C57BL/6小鼠随机分为对照组、H7N9组、H7N9+SP组,后两组制备H7N9低致病性病毒感染模型,造模后H7N9+SP组给予JNK抑制剂SP600125腹腔注射、连续3d。比较三组小鼠肺组织的病毒拷贝数、形态学改变、细胞凋亡率、炎症细胞因子含量、信号通路分子及凋亡分子表达量。结果显示:与对照组比较,H7N9组大鼠肺组织中H7N9病毒的拷贝数、细胞凋亡率、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的含量、JNK的磷酸化水平、Bax、cleaved-caspase-3的表达量明显增加(P0.05),Bcl-2的表达量明显减少(P0.05),p38MAPK、ERK1/2的磷酸化水平无明显变化(P0.05);与H7N9组比较,H7N9+SP组大鼠肺组织中H7N9病毒的拷贝数无明显变化(P0.05),细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、JNK的磷酸化水平、Bax、cleaved-caspase-3的表达量明显减少(P0.05),Bcl-2的表达量明显增加(P0.05)。本研究揭示H7N9禽流感病毒感染小鼠的肺损伤部分由JNK/MAPK通路的激活所介导。     

2015年湖南部分地区H9N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化

我国湖南地区因水禽家禽饲养较多且密集,是流感病毒高发省份。为了监测流感病毒的变异情况,采用RT-PCR技术扩增了10株H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因,并进行了序列测定和分析。结果显示,10株分离株均属于欧亚分支中的Y280亚系;HA碱性裂解位点序列均为RSSR↓GLT,为低致病性流感病毒特征;HA受体结合位点234位均为L,具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性;NA蛋白均在颈部 (63–65位) 出现氨基酸缺失,这种缺失能增加流感病毒在哺乳动物中的复制能力。提示H9N2亚型毒株近年有毒力和致病力趋于转强的可能性,因此,要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注它的重组趋势。     

板蓝根颗粒对甲型流感病毒小鼠的作用

目的测定板蓝根颗粒抗流感病毒的药效作用。方法 A/California/7/2009（CA7）病毒滴鼻感染BALB/c小鼠观察14d,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用,计算小鼠存活率、存活天数以及延长生命率。感染的小鼠第5天每组小鼠处死一半,取肺组织,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织的保护作用。结果板蓝根可明显延长甲型H1N1流感病毒感染小鼠的存活天数并提高存活率,病理结果显示板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠的肺组织有一定程度的保护作用,与模型组比较差异显著（P〈0.05）。结论板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有较好的保护作用。     

H7N9和H1N1流感病毒感染BV2细胞的差异表达miRNA初步分析

筛选鉴定H7N9病毒感染BV2细胞的特异聚类microRNA(miRNA)并初步探讨这些miRNA的可能致病机制。H7N9和H1N1流感病毒感染BV2细胞,分别收集12 h、24 h和48 h的细胞并提取总RNA。并利用高通量测序技术进行miRNA测序,同时比较鉴定不同病毒特异性miRNA。筛选出了10个H7N9病毒特异聚类miRNA,其中有3个miRNA被miRBase数据库所收录。这些特异聚类miRNA调控诸多信号通路的信号传导,比如Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、轴突导向和癌症相关基因等。该研究为miRNA调控H7N9禽流感病毒的致病机制提供了科学基础。     

新型H7N9病毒在同居小鼠中的传播途径

目的进一步了解新型H7N9流感病毒的致病性、传播能力以及通过何种途径进行传播。方法 H7N9病毒感染小鼠后与同居小鼠合笼,研究同居小鼠的临床变化指征、病毒复制情况、病毒在组织中的分布以及病理变化。以同居小鼠分泌物接种其他小鼠,观察同居小鼠通过何种途径传播病毒。结果 H7N9病毒可以在肺组织、肠组织和脑组织中复制,并可以在同居小鼠中传播。H7N9病毒感染小鼠其咽、眼分泌物以及粪便均具有感染性,其中尤以咽拭子的传播风险最高。结论 H7N9病毒可以不通过适应就感染小鼠,并引起小鼠间传播。被感染小鼠分泌物具有感染性。     

利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Importin-α7对流感病毒生长特性的影响

流感病毒的跨种传播是一个包含病毒和宿主因子之间大量相互作用的复杂过程。除了转换细胞表面受体结合特异性,禽流感病毒还要克服核膜形成的另一个重要屏障–核输入机制来进入细胞核进行有效转录和复制。本文主要研究人源importin-α7对不同来源、不同亚型流感病毒生长的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则分别在人importin-α7功能域第5和第6个外显子设计一对小向导RNA(sgRNAs)并克隆入pX459载体,重组质粒共转染A549细胞,构建A549-importin-α7-KO细胞系;再分别用不同来源(人源、猪源和禽源)、不同亚型的甲型流感病毒与乙型流感病毒感染A549-importin-α7-KO细胞和野生型A549细胞,研究importin-α7对流感病毒生长特性的影响。经测序和Western blotting验证,成功构建A549-importin-α7-KO细胞系;激光共聚焦观察结果显示,importin-α7敲除后vRNPs入核减少;同时Importin-α7敲除后流感病毒的生长均受到抑制,其中importin-α7对人流感病毒A/California/04/2009(H1N1)和B/Brisbane/60/2008、禽流感病毒A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)、猪流感病毒A/Hunan/42443/2015(H1N1)和A/Jiangsu/1/2011(H1N1)的生长影响显著,而人流感病毒A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)和禽流感病毒A/Guangzhou/333/99(H9N2)在两种细胞中的生长差异不明显。不同流感病毒结合importin-α的特异性不同,提示流感病毒可能已经进化出不同机制来利用importin-α亚型进行核输入,这对于流感病毒的宿主适应性和致病力研究具有重要意义。     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管内血栓形成

目的本实验旨在观察不同品系小鼠感染甲型流感病毒后肺组织内血栓形成的情况。方法使用H1N1病毒A/California/7/2009（CA7）株和H3N2病毒A/Brisbane/10/07株,对BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒。检测小鼠感染后肺组织病毒拷贝数并观察肺组织病理学改变。结果 H1N1和H3N2滴鼻攻毒的各组小鼠均染毒,病理表现为程度略有差异的间质性肺炎。13只H1N1病毒感染小鼠和6只H3N2感染小鼠在肺组织中观察到多个小血管内有血栓形成,血栓成分主要为纤维素和血小板。结论各品系小鼠感染H1N1和H3N2流感病毒后均可能出现肺组织内血栓形成。     

PB2蛋白T271A突变增强了欧亚类禽猪流感病毒在小鼠中的致病力

目前,欧亚类禽猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EA H1N1 SIVs)在我国猪群中广泛流行,同时可跨越种属屏障感染人。PB2-T271A是H5N1、H7N9和2009年甲型H1N1流感病毒中关键的分子标记,可增加病毒在小鼠中的致病力。但是,PB2-T271A对EA H1N1 SIVs的影响尚不清楚。在本研究中,我们分析了PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs在细胞和小鼠中复制能力的影响。本研究发现,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在哺乳动物细胞和禽细胞中的复制能力,增加了EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力。此外,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs的聚合酶活性。因此,我们应该加强对EA H1N1 SIVs中PB2-T271A位点的监测。     

格尔德霉素抑制高致病性禽流感病毒增殖及其所介导炎性反应研究

对高致病性禽流感病毒感染最为有效的治疗应采用抗病毒和抗炎症的联合治疗．本试验用流感病毒H5N1感染不同细胞株(A549细胞和MDCK细胞),采用不同浓度格尔德霉素对病毒感染细胞培养物作用不同时长,检测流感病毒滴度;ELISA检测格尔德霉素作用于流感病毒H5N1感染A549细胞12 h、24 h促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6水平．结果显示,流感病毒H5N1感染A549细胞和MDCK细胞,格尔德霉素极显著地抑制了流感病毒H5N1在细胞培养物的增殖(P < 0.01),而在病毒感染36 h和48 h,格尔德霉素并没有显著抑制流感病毒在MDCK细胞上的增殖(P > 0.05)．促炎性细胞因子分析结果显示,格尔德霉素在流感病毒感染A549细胞12 h和24 h均显著降低了促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌(P < 0.05)．上述实验结果显示,格尔德霉素具有抑制流感病毒H5N1增殖及其所介导的炎性反应的双重效应,为格尔德霉素成为应对流感病毒流行的备选药物提供基础科学依据．     

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化和作用

目的探讨H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子的变化和作用。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,于感染后2、4、6、10、14 d取小鼠肺组织匀浆,分别测定肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。结果实验组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10在不同时间点浓度均显著高于正常对照组(P<0.05),TNF-α和IL-1β于14 d后趋于正常,而IL-6和IL-10增高持续至14d后。结论 H9N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子发挥重大作用,TNF-α和IL-1β起致炎作用,IL-6可能和IL-10一样,发挥抗炎作用。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制。方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润。综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系。结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高。H1N1病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异。但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应。结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

甲型H9N2流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体的制备及保护效果研究

目的制备甲型H9N2流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase, NA)单克隆抗体(简称单抗),研究其特性,并在小鼠体内评估NA单抗的保护效果。方法用H9N2 NA质粒经肌肉注射并辅以电脉冲免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术筛选出小鼠单抗M53,采用酶联凝集素测定法(enzyme-linked lectin assay, ELLA)和NA-XTD法测定其NA酶抑制活性,同时还进行了空斑抑制试验,以确定单抗M53对犬肾细胞中H9N2病毒复制的影响。此外,评估了单抗M53对H9N2流感病毒感染小鼠的预防和治疗性效果。结果在NA抑制试验中,单抗M53可抑制H9N2 NA对大分子胎球蛋白和小分子NA-XTD底物50%的裂解,IC_(50)分别约为4.48μg/mL和29.50μg/mL,表明单抗M53能够抑制H9N2病毒NA的活性。在空斑抑制试验中,当单抗M53浓度≥200μg/mL时,可显著抑制H9N2病毒在细胞间的低浓度传播。小鼠模型中,在H9N2病毒感染前24、48和72 h,使用30或10 mg/kg的单抗M53免疫1次,就可保护所有小鼠抵抗之后致死量的病毒攻毒,并显著降低小鼠肺部病毒载量。结论抗H9N2流感病毒的单抗M53具有作为流感病毒辅助治疗的潜力。