EV71与CA16双价灭活疫苗诱导小鼠免疫原性研究

目的评价EV71和CA16双价灭活疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫和细胞免疫应答。方法分别应用EV71和CA16双价疫苗、EV71和CA16单价疫苗按单针、两针(0,14 d)的程序免疫小鼠,采用细胞病变法检测血清第1针免疫后21 d时中和抗体效价,应用LUMINEX液相芯片技术检测小鼠脾单个核细胞体外经抗原刺激分泌细胞因子的水平。结果双价疫苗与EV71单价疫苗单针、两针免疫相比,EV71中和抗体几何平均值相近(118.8∶84.0;159.5∶156.8,P0.05)。双价疫苗与CA16单价疫苗单针免疫诱导的CA16中和抗体均为阴性;两针免疫CA16中和抗体几何平均值一致(30.0∶26.9,P0.05)。加强免疫7 d后,小鼠脾MNC经EV71抗原刺激,双价疫苗较EV71单价疫苗诱导Th2类细胞因子IL-4、5、6、10和炎症因子TNF-α的分泌水平显著增高(P=0.020,P=0.027,P=0.038,P=0.019,P=0.026);MNC经CA16抗原刺激,双价疫苗与CA16单价疫苗相比诱导细胞因子水平差异无统计学意义(P0.05)。结论双价疫苗可诱导与单价疫苗相似的中和抗体应答水平,并可提高Th2类细胞因子应答,研究为EV71和CA16双价灭活疫苗的研发提供了实验依据。     

EV71多表位抗原亲和纯化及类病毒颗粒胞外自组装

利用肠道病毒71型（EV71）衣壳蛋白优势表位肽段构建融合蛋白抗原能有效抑制病毒感染,有望成为继灭活病毒后更为安全有效的疫苗品种。该融合蛋白能通过原核体系有效表达但形成无序包涵体,采用常规层析介质难以实现目标蛋白与宿主杂质的有效分离,阻碍了对该抗原蛋白进行全面临床前活性及安全性评价。在原有融合蛋白抗原N端插入组氨酸标签,对形成的包涵体变性溶解后直接采用镍金属螯合亲和介质进行分离纯化,获得了纯度大于95%的抗原纯品,目标蛋白收率46.8%。采用透析方式脱除纯化样品中高浓度脲,发现直接透析至无脲的缓冲液中蛋白质大量沉淀,而先稀释至2mol/L脲的缓冲液中然后用G25脱盐柱完全脱除脲则无任何沉淀形成,获得近100%的蛋白质收率。透射电镜分析最终样品发现融合蛋白形成了10nm左右粒径均一的类病毒蛋白颗粒,且在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中保持稳定。该研究结果为将EV71融合蛋白抗原发展为安全有效且低成本的手足口疫苗奠定了基础。     

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

目的利用原核表达技术制备人肠道病毒71型（EV71）的亚单位融合疫苗,并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段,随后将肽段免疫雌鼠,对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染,通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化,对疫苗的保护效果进行评价。结果通过肽段融合的方法,得到五种备选疫苗,分别为VacA,VacB,VacC,VacD和VacE,这五种疫苗均具有一定的体外保护能力,并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示,VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗,VacB和VacE的保护效果较好,此外,VacB与人脑组织间无明显交叉反应,可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。     

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR（overlap extension PCR）法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC（44815）质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221（DE3）进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。     

EV71结构蛋白VP0的表达及抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP0(VP2+VP4)并制备其多克隆抗体.方法:以肠道病毒71型(EV71)全基因组为模板,设计引物扩增出目的片段VP0,将其克隆至表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序.将重组表达载体pET-30a (+)-VP0转入大肠杆菌表达菌株Rosetta中.该重组菌经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot验证后,有与预期分子量大小一致的蛋白条带,并且主要以包涵体的形式存在.包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备了VP0多克隆抗体,并对该抗体进行了细胞免疫荧光分析.结果:经过大肠杆菌重组表达并纯化得到了纯度较高的VP0蛋白,制备的多克隆抗体经过细胞免疫荧光的验证表明反应性良好.结论:成功地表达VP0蛋白并制备了其多克隆抗体,有利于EV71病毒的检测及下一步对其疫苗的研究.     

肠道病毒EV71疫苗效力国家参考品的协作标定

目的建立肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)疫苗效力参考品,用于EV71疫苗效力的小鼠ED50检测质量控制。方法选取经Ⅲ期临床试验验证具有良好保护效果的一批EV71疫苗作为候选参考品,采用EV71小鼠ED50检测方法,对候选参考品进行效力的协作标定及适用性研究。结果候选参考品在各实验室的ED50均值分别为9.5~51.0 U,CV为3.8%~18.7%;5个实验室总均值为23.5 U,CV为60.9%。各实验室检测结果均符合正态分布;3个EV71灭活疫苗与参考品均表现出了良好的剂量效应关系,中和抗体阳转率均随疫苗稀释度的增加而降低,下降曲线形态相近。当以候选参考品为标准,3个灭活疫苗的体内效价比均值分别为2.7倍、0.8倍和0.9倍;CV分别为5.5%、27.5%和11.2%。结论建立的EV71疫苗效力国家参考品(320 U/0.5 m L),可用于EV71疫苗效力的小鼠ED_(50)检测质量控制。     

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达

目的：用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法：通过对GenBank发表的猪细小病毒（Porcine Par-vovirus,PPV）中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a（＋）上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达。结果：重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论：NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型（EV71）RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用

将构建好的重组质粒pMD-VP2a、pMD-VP2b分别经双酶切获得基因片段VP2a、VP2b,分别将其定向插入到原核表达载体pMAL-c2中,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,经IPTG诱导,两段基因均获得表达;Westernblot分析表明表达蛋白具有良好的抗原性。用KCI染色后,切胶回收的方法对表达蛋白进行纯化,以纯化的目的蛋白作为诊断抗原初步建立了水貂阿留申的VP2-CIEP诊断方法。结果表明该方法具有较高的灵敏性和特异性,与传统的CIEP方法的检出符合率达94.3%。     

肠道病毒71型2C蛋白原核表达及抗体制备

肠道病毒71型(EV71)的非结构蛋白2C(P2C)在病毒复制周期中起着重要的作用,制备P2C的特异性抗体,对研究P2C的生物学功能以及EV71与宿主相互作用的具体机制有非常重要的意义。实验将2C基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)上,在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达出重组蛋白r P2C,进一步优化原核表达条件,在温度为30℃,诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白表达量最高,且主要以包涵体形式存在。直接将获得的r P2C通过SDS-PAGE分离后免疫新西兰兔,制备EV71病毒P2C的兔多克隆抗体。通过Western blot检测,该抗体在110 000稀释比例下仍能很好地识别原核表达的r P2C。同时该抗体也能很好地检测到EV71感染RD细胞中的P2C。因此,实验制备出的抗P2C抗体特异性强、效价高,为后续P2C功能的研究以及EV71病毒检测提供了良好的材料。     

肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究

本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究。首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究。经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a-3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD;纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1;其最适反应pH为7.0,最佳反应温度为30℃～37℃。本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础。     

诺如病毒GII.6 P粒子原核表达与纯化

原核表达的诺如病毒(Noroviruses,NoV)衣壳蛋白亚基P粒子与No V有相同的抗原类型,可以代替NoV在体外进行结合,这对于研究该病毒与宿主和环境载体结合的相关机理有重大意义。本研究成功构建GII.6 P粒子基因表达载体,并对原核表达体系中诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间进行优化。结果表明表达载体在22℃、2×10~(-4)mol/L IPTG诱导22 h后表达量最高。随后,在亲和层析的基础上结合阴离子交换以及凝胶过滤层析对表达产物进行纯化,最终获得高纯度GII.6 P粒子。     

Myristoylation of EV71 VP4 is Essential for Infectivity and Interaction with Membrane Structure

Virologica Sinica - The Enterovirus 71 (EV71) VP4 is co-translationally linked to myristic acid at its amino-terminal glycine residue. However, the role of this myristoylation in the EV71 life...     

诺瓦克病毒ORF2的原核表达及其产物分析

诺瓦克病毒(Norovirus,NV)是1972年在美国首次发现的新生病毒,直到1995年国内才有报道.该病毒是严重危害人类健康的重要食源性病毒,可导致不同年龄阶段人群的急性病毒性腹泻.实验以提取临床NV阳性腹泻样本的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到全长为1623 bp编码NV主要衣壳蛋白VP1的ORF2全基因序列.将测序结果进行进化分析,结果表明该病毒属于NV GⅡ.将ORF2亚克隆到原核表达载体pET-28a构建原核表达载体,鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达,获得大小约62 kD的融合蛋白并命名为rVP1.以纯化的rVP1免疫新西兰大白兔后制备高免血清,Western Blot结果表明,实验所获得的多克隆抗体可以特异性识别临床样本中NV VP1.因此,rVP1具有良好的免疫原性和反应原性.对小于rVP1的蛋白条带进行Western Blot分析,结果表明所有条带均为rVP1的部分蛋白.双向琼脂扩散试验结果显示实验所获得的高效价多克隆抗体与纯化的原核表达产物仅形成单一沉淀带.     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

采用经典微量细胞病变法,应用近两年分离自中国手足口病(HFMD)高发区的3株肠道病毒71型(EV71)病毒株,对中国不同血液制品厂家生产的35批人免疫球蛋白制品进行抗-EV71中和效价检测。结果显示,3株不同EV71病毒株间的抗-EV71中和效价差异均在4倍以内,差异无显著的统计学意义(F=2.323,P0.05)。根据这3株毒株检测结果判定,35批人免疫球蛋白的抗-EV71均为阳性,肌肉注射用免疫球蛋白(简称肌丙)的抗-EV71-GMTs(525.9)显著高于静脉注射用免疫球蛋白(简称静丙)的GMTs(252.3,F=66.518,P0.01)。30批静丙的抗-EV71-GMTs中和效价分布在128.0~384.0之间。应开展原料血浆中抗-EV71中和效价的筛选,研制高效价的EV71特异性免疫球蛋白制品,用于HFMD的治疗和预防。