EB病毒潜伏膜蛋白1诱导人鼻咽上皮细胞端粒酶的表达

上皮细胞逃避老化期是细胞永生化过程中一个重要分子事件,端粒酶活性表达是维持人染色体端粒长度、抑制细胞进入老化期的关键因素之一.我们利用最新的端粒酶PCR-ELISA半定量技术,检测永生化早期阶段人胚鼻咽上皮细胞中端粒酶表达的情况,探讨EB病毒在人胚鼻咽上皮细胞永生化过程中的分子机制.结果表明,EB病毒诱导老化前期人胚鼻咽上皮细胞端粒酶表达,从而促使人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段.此外,我们还首次发现,人胚鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性依赖于EB病毒LMP1蛋白的表达水平和LMP1分子的完整性,LMP1可能通过诱导端粒酶活性表达促进人鼻咽上皮细胞永生化.我们的实验为进一步探讨EB病毒诱导人胚鼻咽上皮细胞永生化的作用机制提供了实验基础.     

EB病毒LMP-1上调鼻咽癌细胞系AP-1的活性

为了探讨 EB病毒潜伏膜蛋白 1 ( LMP- 1 )通过信号传导途径介导的致瘤分子机制 ,由此首先构建了 AP- 1报告基因 ,用佛波酯诱导确定了其报道 AP- 1的功能 ;通过建立荧光素酶双报道系统 ,研究了 LMP- 1表达对 AP- 1和 NFκB活性的影响 .研究发现 :在 LMP- 1阴性鼻咽癌 ( NPC)细胞系 ,导入 LMP- 1表达质粒后 ,AP- 1和 NFκB的活性均升高 4～ 5倍 ;而在 LMP- 1阳性 NPC细胞系中 ,当导入 LMP- 1反义表达质粒 ,AP- 1和 NFκB的活性则受抑制 ,活性下调 3～ 4倍 .结果表明 ,LMP- 1能上调 NPC细胞系 AP- 1的活性 ,同时再次证实了 LMP- 1能活化 NFκB.     

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的致瘤机制,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF－κB机制进行了研究,首先,采用免疫共沉淀－蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2－LMP1中证实LMP1与TRAF1,2,3结合形成免疫共沉淀复合物,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1（野生型, wt),HNE2－LMP1 del187-351(CTAR1缺失型）,HNE2－LMP1（1－231）,（CTAR2缺失型）,HNE2－LMP1（1－187）（羰基端胞浆区缺失型）,HNE2－pSG5(空白载体型）为材料,结合NF－κB报道基因质粒（pG12-NF-B-luc)的荧光素酶活性表达分析NF－κB的活性,证实：较之母细胞,野生型LMP1活化NF－B达13．8倍,LMP1（1－187）几乎不活化NF－kb,LMP1(1-231)活化NF－kB 达4．9倍,LMP1（del187-351)活化NFκB达9．1倍,TRAF1过表达升高LMP1（ wt)及LMP1（1－231）介导的NF－κB活性,而对LMP1（del187-351)活化NFκB无影响,TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑,制LMP1（wt)及LMP1（1－231）介导的NF－κB活性而不影响LMP1（del187－351）活化NF－κB,TRAF2过表达升高LMP1（wt),LMP1(1-231)及LMP1（del 187-351)介导的NF－kB活性,这些结果表明：鼻咽癌中LMP1通过TRAF1,TRAF2或TRAF3调控NF－kB,TRAF1和TRAF3主要通过CTAR1发挥作用,TRAF2的作用主要是通过CTAR1和CTAR2介导的。     

NF—κB信号通路在绿脓菌素诱导气道上皮表达IL-8的作用

探讨绿脓菌素对人气道上皮细胞株（NCI—H292细胞）表达IL-8的诱导作用及通过NF—κB信号传导通路。采用ELISA法对PCN诱导NCI-H292细胞分泌IL-8进行分析,应用westernblotting检测NF-κB的蛋白表达,观察NF—κB阻断剂对IL-8表达的影响。PCN可促进NCI-H292细胞IL-8分泌。NF—κB的阻断剂PDTC能显著抑制IL培表达（P〈0．01）。PCN可能通过NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达。     

GCG干预LMP1激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子

为阐明在鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白 1(latentmembraneprotein 1,LMP1)激活的NF κB信号转导通路中的靶分子 ,采用EBV阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1 LMP1细胞 ,利用噻唑蓝 (MTT)法 ,观察表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)对CNE1和CNE1 LMP1细胞生存率的影响 .采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对NF κB活性的作用 .利用间接免疫荧光法 ,观察EGCG对NF κB (p6 5 )核移位的影响 ,再分别提取CNE1和CNE1 LMP1的胞浆及胞核蛋白 ,通过蛋白质印迹分析EGCG抑制NF κB (p6 5 )的核移位后胞浆及胞核蛋白中NF κB (p6 5 )的变化 .采用蛋白质印迹分析EGCG对IκBα的磷酸化水平的影响 .采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对EGFR启动子活性的影响 ,并用蛋白质印迹分析EGCG对EGFR自身磷酸化的作用 .结果表明EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性 ,并可抑制NF κB的活性 .EGCG能抑制NF κB (p6 5 )的核移位 ,并抑制IκBα的磷酸化 .EGCG对NF κB信号通路下游的靶基因EGFR的启动子活性及自身磷酸化都有抑制作用 .由上述结果可以推断 ,EGCG对信号转导通路上的NF κB、NF κB (p6 5 )、IκBα、EGFR多个靶点分子具有干预作用 .LMP1是EB病毒编码的蛋白质 ,因此 ,EGCG抑制     

绿脓菌素激活MAPKs、NF-KB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株A549和SPC-A-1,用ELISA方法检测细胞IL-8分泌水平,并使用免疫印迹(Western blot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NF—κB及丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)的激活作用。实验发现,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株IL-8分泌增加,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内IκB—α发生降解,同时使MAPK家族蛋白分子(ERK1／2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1／2(ERK1／2激酶)抑制剂U0126(10μmol／L)和p38MAPK抑制剂SB203580(10μmol／L)可降低绿脓菌素诱导A549细胞IL-8的合成。以上结果显示绿脓菌素通过MAPK信号传导通路增强呼吸道上皮细胞IL-8的表达;NF-κB通路也参与了绿脓菌素调控细胞IL-8表达的过程。     

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的致瘤机制,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF-κB机制进行了研究.首先,采用免疫共沉淀-蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF1,2,3结合形成免疫共沉淀复合物,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1（野生型,wt）、HNE2-LMP1 del187～351(CTAR1缺失型)、HNE2-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型)、HNE2-LMP1(1～187)(羧基端胞浆区缺失型)、HNE2-pSG5(空白载体型)为材料,结合NF-κB报道基因质粒（pGL2-NF-κB-luc）的荧光素酶活性表达分析NF-κB的活性,证实:较之母细胞, 野生型LMP1活化NF-κB达13.8倍, LMP1(1～187)几乎不活化NF-κB,LMP1(1～231)活化NF-κB达4.9倍, LMP1(del187～351)活化NF-κB达9.1倍;TRAF1过表达升高LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而对LMP1(del 187～351)活化NF-κB无影响;TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑制LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而不影响LMP1(del 187～351)活化NF-κB; TRAF2过表达升高LMP1(wt)、LMP1 (1～231)及LMP1(del 187～351)介导的NF-κB活性.这些结果表明：鼻咽癌中LMP1通过TRAF1、TRAF2或TRAF3调控NF-κB,TRAF1和TRAF3主要通过CTAR1发挥作用,TRAF2的作用主要是通过CTAR1和CTAR2介导的.     

EBV LMP1通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT

利用原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet on LMP1HNE2等良好的细胞体系,采用报道基因法和Westernblot法等,分别检测Epstein Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)诱导的c myc反式激活活性和蛋白表达水平,从LMP1诱导细胞内c myc表达的角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制。结果表明,LMP1促使细胞内c myc反式激活活性增强,c Myc蛋白表达量升高;导入反义LMP1表达质粒阻断LMP1表达后,c myc反式激活活性下降。将端粒酶hTERT启动子上c myc结合位点突变后,LMP1不能诱导端粒酶hTERT表达。因而认为,EB病毒LMP1通过诱导c myc表达而活化端粒酶hTERT。     

绿脓菌素激活MAPKs、NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL8表达

采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株A5 4 9和SPC A 1,用ELISA方法检测细胞IL 8分泌水平 ,并使用免疫印迹 (Westernblot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NF κB及丝裂原激活蛋白激酶 (MAPKs)的激活作用。实验发现 ,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株IL 8分泌增加 ,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内IκB α发生降解 ,同时使MAPK家族蛋白分子 (ERK1 2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1 2 (ERK1 2激酶 )抑制剂U0 12 6 (10 μmol L)和p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80 (10 μmol L)可降低绿脓菌素诱导A5 4 9细胞IL 8的合成。以上结果显示绿脓菌素通过MAPK信号传导通路增强呼吸道上皮细胞IL 8的表达 ;NF κB通路也参与了绿脓菌素调控细胞IL 8表达的过程     

NF-κB的结构功能及其与疾病的关系

NF-κB蛋白家族在哺乳动物的生长发育和免疫反应中具有重要作用。NF—κB信号传导途径的改变会引起多种炎性疾病和肿瘤的发生。该主要介绍近些年来在NF—κB及其相关蛋白的主要结构和生物学功能方面的研究进展,同时揭示NF—κB蛋白家族与炎症、肿瘤疾病之间存在的关系,探讨NF—κB相关蛋白抑制剂的应用。     

转化生长因子β激活性激酶在胶质细胞信号转导中的作用机制

丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和 NFκB介导了炎症细胞转录活性的信号转导过程.转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1,TAK1）是这些转导通路的上游激酶.通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的结合蛋白因子（TAK1-binding protein1 TAB1）基因,或与iNOS(可诱导型氧化氮合酶基因)启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒共转染,探讨中枢两类胶质细胞在炎症反应过程中TAK1诱导iNOS 和细胞因子表达的作用机制.结果显示,TAK1明显激活iNOS 和细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）的表达活性. 而且当使用它的下游激酶p38 MAPK、JNK和NFκB的抑制剂（SB203580、SP620125和CAPE）后,这些表达活性明显被抑制.用IκBα的磷酸化突变体质粒(IκBαM)共转染胶质细胞株,能完全抑制iNOS的表达活性.研究结果提示：在胶质细胞内的p38 MAPK、JNK和NFκB信号介导的iNOS和细胞因子的转录表达过程中,TAK1起着非常重要的调节作用.     

肺内调节肽对支气管上皮细胞ICAM-1表达及NF-κB活性的调控

细胞间粘附分子—1(ICAM—1)是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子;核因子—κB(NF—κB)是体内普遍存在、能迅速对刺激产生反应的重要核转录因子。越来越多的证据显示,ICAM—1表达与NF—κB激活是炎症反应的重要步骤。我们应用免疫组化、RT—PCR、凝胶阻滞电泳(EMSA)等多种实验方法,观察了肺内调节肽对支气管上皮细胞ICAM—1表达及NF—κB活性的影响,以及NF—κB抑制剂MG—132对ICAM—1表达的影响。实验结果发现,VIP、EGF可使臭氧应激BECS的ICAM—1表达降低;ET—1、CGRP可使未受应激BECs的ICAM—1表达增加。NF—κB抑制剂MG—132可阻断O3、ET—1、CGRP引起的ICAM—1表达,提示NF—κB在调控ICAM—1表达中起重要作用。EMSA结果显示,BECs中NF—κB在臭氧应激下反复激活,CGRP与ET—1可促进NF—κB的激活;VIP与EGF可抑制臭氧应激的BECs中NF—κB的激活。以上结果说明,VIP、EGF可通过下调ICAM—1转录及NF—κB激活减轻炎症反应,而ET—1、CGRP可通过上调ICAM—1转录及NF—κB激活、加大炎症反应。ICAM—1与NF—κB的持续表达和反复激活是炎症持续加重发展的重要因素。     

鼻咽癌细胞5-8F通过TLR4介导的信号通路对革兰氏阴性细菌脂多糖的反应性研究

鼻咽上皮细胞无时无刻不暴露和接触到共生微生物与病原微生物,机体依靠天然防御系统和抗原识别的适应性免疫反应系统来进行自我保护.慢性感染的重要毒力因素被认为是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS),对LPS的识别与信号传导是宿主细胞抵御革兰氏阴性细菌的关键.通过流式细胞术、RT-PCR等研究发现,5-8F细胞可与LPS相结合并产生反应,且其受LPS调节的机制是由于5-8F细胞中存在LPS受体分子如CD14、TLR4与MD2等的表达.同时应用免疫荧光、蛋白质印迹、荧光素酶报告系统等研究发现,5-8F细胞可受到LPS的诱导而活化TLR4的下游信号传导通路.5-8F细胞在LPS的诱导下,磷酸化NFκBp65的表达增加,并且使NFκBp65活化迁移至核内.研究还发现,LPS增加TNF-α全长启动子活性,同时LPS可使5-8F细胞中TNF-α的分泌增加,从而介导炎性因子的释放.因此,5-8F细胞可通过与LPS受体分子:CD14、TLR4及MD2与LPS相结合并反应,从而激活TLR4介导的NFκB信号通路,使炎性因子的释放增加,导致鼻咽部的炎症反应诱发鼻咽癌.     

高糖诱导肾小球系膜细胞表达TNFα-的机制探讨

目的:初步探讨高糖诱导肾小球系膜细胞表达肿瘤坏死因子α(TNFα-)的机制。方法:分别用p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)特异性抑制剂SB203580、核因子-κB(NFκ-B)特异性抑制剂PDTC预刺激肾小球系膜细胞30 min,再以高糖(20 mmol/L)干预48 h后,分别采用RT-PCR法检测系膜细胞内TNFα-mRNA水平,Western blot法检测系膜细胞内磷酸化p38MAPK蛋白水平、细胞核及细胞浆NFκ-B p65蛋白水平。结果:与低糖对照组相比,高糖可促进肾小球系膜细胞内TNFα-mRNA表达,以及p38MAPK、NFκ-B蛋白活化;SB203580(10 mmol/L)、PDTC(10 mmol/L)预刺激肾小球系膜细胞均可抑制高糖诱导肾小球系膜细胞表达TNFα-,且SB203580可抑制高糖诱导系膜细胞内NFκ-B蛋白活化。结论:p38MAPK-NFκ-B信号途径参与介导高糖诱导肾小球系膜细胞表达TNFα-。     

EB病毒LMP-1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP-1活化

 EB病毒潜伏膜蛋白 1 (latentmembraneprotein 1 ,LMP 1 )活化激活蛋白 1 (activatorprotein 1 ,AP 1 )信号传导途径与其致瘤作用密切相关 .为了探讨LMP 1活化AP 1信号传导的分子机制 ,在可诱导调控LMP 1表达的鼻咽癌细胞系L7中 ,首先通过荧光酶双报道系统确定了LMP 1表达能激活AP 1 ;在此基础上 ,用c JunPathDetect系统确定LMP 1表达活化AP 1是通过c Jun的磷酸化 (活化 )介导 .虽然LMP 1不能上调c Jun上游主要调节激酶c JunN端激酶 (c JunN terminalkinase ,JNK)的蛋白表达 ,但能显著促进JNK的磷酸化 (活化 ) ;在L7细胞中导入JNK相互作用蛋白 (JNK interactingprotein ,JIP)基因 ,抑制JNK的核移位能显著抑制LMP 1诱导的AP 1活化 ,同时对NFкВ活化也有部分抑制作用 .结果表明 ,EB病毒LMP 1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP 1活化     

瘦素对血管平滑肌细胞核转录因子κB的影响

目的探讨瘦素(leptin)对血管平滑肌细胞(VSMCs)核转录因子(NF-κB)的影响。方法贴块法原代培养VSMCs;分别采用MTT法检测leptin对VSMCs增殖活性的影响,免疫荧光-共聚焦显微镜和蛋白印迹技术检测Lep-tin对VSMCs中NF?κB的细胞内定位和VSMCs核中NF?κB的蛋白含量。结果leptin对VSMCs具有促进细胞增殖的作用,这种促增殖活性具有剂量依赖性;Leptin能促进VSMCs中的NF?κB从胞质转移至细胞核,并且这种作用也具有剂量依赖性。结论Leptin能促进VSMCs增殖,能激活VSMCs中NF?κB,使其从胞质转位至胞核;同时,目前已有的研究已经证明NF?κB与平滑肌细胞的增殖和迁移关系密切,提示Leptin促进VSMCs的增殖作用中可能有NF?κB信号传导通路的参与。     

EBV LMPl通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT

利用原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet—on—LMP1 HNE2等良好的细胞体系,采用报道基因法和Western blot法等,分别检测Epstein—Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMPl)诱导的c—myc反式激活活性和蛋白表达水平。从LMPl诱导细胞内c—myc表达的角度,探讨LMPl诱导端粒酶表达的分子机制。结果表明,LMPl促使细胞内c-myc反式激活活性增强,c-Myc蛋白表达量升高;导入反义LMPl表达质粒阻断LMPl表达后。c—myc反式激活活性下降。将端粒酶hTERT启动子上c—myc：结合位点突变后,LMP1不能诱导端粒酶hTERT表达。因而认为,EB病毒LMPl通过诱导c—mvc表达而活化端粒酶hTERT。     

IKKα通过不同机制介导生长促进和生长抑制信号诱导的c-Fos表达和AP-1活化

目的:探讨IKK激酶催化亚基IKKα在分别介导生长促进信号(血清)和生长抑制信号(紫外线UVB)诱导的反应中,调控转录因子AP-1关键组成亚基c-Fos实现诱导表达的信号传递机制。方法:分别采用Western印迹、RT-PCR和萤光素酶报道分析系统检测血清和紫外线刺激反应状态下IKKα对c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化的调控作用;通过转染I-κBα功能抑制型突变体I-κBα-AA,观察NF-κB诱导活化受抑时,c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化水平的改变情况。结果:IKKα在生长促进和生长抑制信号诱导的反应中,都能够实现对转录因子AP-1及其关键组成亚基c-Fos诱导表达的调控作用。其中,在血清反应中IKKα可通过NF-κB依赖方式在转录水平调控c-Fos的诱导表达,而在UVB反应中IKKα通过转录非依赖方式调控c-Fos的诱导表达。结论:IKKα能分别以NF-κB依赖和非依赖方式参与调控生长促进和生长抑制信号诱导的反应。     

脑组织核因子-κB激活对实验性变态反应性脑脊髓炎的作用

为探讨脑组织核因子－κB（NF－κB）对实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的作用,分别用凝胶电泳迁移分析和NF－κB p65免疫组化方法测定了CFA－GPSCH诱导大鼠EAE1、7、14和21d时脑组织NF－κB活性和蛋白表达的动态变化,并观察了这些变化与EAE症状之间的关系。结果表明;对照组大鼠脑组织仅有少量NF－κB蛋白表达,其活性也很低;诱导EAE后,伴随着大鼠EAE症状及脑组织病理损伤的出现和进行性加重,其NF－κB活性和蛋白表达量逐渐增高;在免疫后14d达到高峰,NF－κB阳性细胞主要位于脉络丛、穹隆下器、血管“套袖样”病灶的周围,与EAE病变部位一致,此时大鼠EAE发病率最高、病情最重、体重减轻最显著、脑组织病理改变也最明显;21h脑组织NF－κB活性和蛋白表达量逐渐下降,大鼠EAE症状也逐渐恢复。应用NF－κB特异性抑制剂PDTC以抑制脑内组织NF－κB活性和蛋白表达量逐渐下降,大鼠EAE症状也逐渐恢复。应用NF－κB特异性抑制剂PDTC以抑制脑内NF－κB蛋白表达后,大鼠EAE症状和脑组织损伤明显减轻,说明脑组织NF－κB的动态变化与EAE症状及脑组织损伤程度密切相关。结论：脑组织NF－κB的激活对EAE的发病起着关键的作用,应用NF－κB抑制剂可能是防治该病的有效方法之一。     

核因子κB的跨核膜转运及其调控机制

核因子kappaB(NF-κB)是一组重要的转录调节因子,当细胞处于静息状态时,它与抑制蛋白IκB结合以非活性的形式存在于胞浆中.当细胞受到多种外界信号刺激,NF-κB、IκB分别在核定位信号（NLS）的介导下经核孔复合物（NPC）转运入核.在核内,NF-κB与IκB再次结合成复合物,在核转出信号（NES）介导下,经CRM1依赖的途迳出核.该过程是能量依赖的主动转运过程,涉及小分子Ran蛋白及多种可溶性因子.