腺嘌呤对体外小鼠卵母细胞减数分裂的抑制

本文研究了嘌呤类物质对小鼠卵母细胞减数分裂的影响,于卵母细胞的生发泡内显微注射腺嘌呤和腺嘌呤的类似物苄基腺嘌呤可显著抑制卵母细胞的分裂的重新启动。同时发现在腺嘌呤的作用过程中,腺苷酸环化酶的激活前氟化钠,可增强其对卵母细胞的抑制作用,表明ｃＡＭＰ途径在小鼠卵母细胞的抑制作用,腺嘌呤在不同培养液中的抑制效果不一,次黄嘌呤在ＤＭＥＭ和ＥＭＥＭ中对小鼠的卵丘细胞－卵母细胞复合体和无卵丘细胞的卵丘细胞－卵     

腺嘌呤对体外小鼠卵母细胞减数分裂的抑制

本文研究了嘌呤类物质对小鼠卵母细胞减数分裂的影响。于卵母细胞的生发泡内显微注射腺嘌呤和腺嘌呤的类似物苄基腺嘌呤可显著抑制卵母细胞的分裂的重新启动。同时发现在腺嘌呤的作用过程中,腺苷酸环化酶的激活剂氟化钠可增强其对卵母细胞的抑制作用,表明cAMP途径在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中起重要作用。腺嘌呤在不同培养液中的抑制效果不一,次黄嘌呤在DMEM和EMEM中对小鼠的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COC)和无卵丘细胞的裸卵(DO)均具有明显的抑制效应。但腺嘌呤在DMEM比在EMEM中对COC的抑制效果更强,而且腺嘌呤在DMEM中与次黄嘌呤具有协同效应,这些差别可能是由于两种培养液中不同成分如谷氨酰胺造成卵母细胞对腺嘌呤吸收差异而引起的。     

山羊卵母细胞的减数分裂进程

The meiotic progression of goat oocytes from follicles of different diameters was investigated in this study. The results were summarized as follows: (1) The in vitro meiotic maturation capacity was different among oocytes from follicles of different diameters. And thus oocytes from < or = 0.5 mm follicles were unable to resume meiosis; oocytes from 0.8-1.2 mm follicles were capable to resume meiosis, but could develop only to MI stage (60% at 24 h); oocytes from 1.5-5 mm follicles had acquired full-meiotic maturation capacity and 91% of them developed to M II stage at 24 h of culture. (2) The percentage of oocytes with intact-germinal vesicles from 1.5-5 mm follicles decreased significantly during 2-8 h of in vitro maturation and the decrease was even more rapid during 4-6 h of culture (from 60% to 19%, p < 0.0005). The percentage of oocytes at M I-stage increased from 24% to 61% during 6-12 h of in vitro maturation, and it then decreased. By 24 h of culture, only 2% oocytes remained at M I-stage. Twenty one percent of the oocytes in this group developed to M II-stage at 16 h of culture, and by 24 h of culture, 91% were at M II-stage. (3) Statistic analysis of the meiotic progression (the duration of each cell cycle stage) of oocytes from 1.5-5 mm follicles showed that GV stage lasted from 0 to 3 h of culture, prometaphase-I stage was from 3.0 to 7.0 h, metaphase-I stage was from 7.0 to 14.6 h, anaphase-I/telophase-I was from 14.6 to 18.4 h and metaphase-II stage lasted from 18.4 to 24 h. (4) Whether the oocytes capable of GVBD and entrance of M I developed to M II, the timing of meiotic progression prior to M I was similar. In summary, our results provided necessary data for studies on the mechanisms and control of meiosis in mammalian oocytes.     

山羊卵母细胞的减数分裂进程

本实验以随机屠宰山羊的卵巢为实验材料,研究了不同直径卵泡卵母细胞的减数分裂进程。结果显示,不同直径卵泡卵母细胞在体外成熟培养条件下的减数分裂能力不同:≤0.5mm直径卵泡的卵母细胞不能恢复减数分裂;0.8-1.2mm卵泡的卵母细胞可恢复减数分裂,但只能发育到MⅠ期,培养24h发育到MⅠ期比率60%;1.5-5.0mm卵泡卵母细胞已经完全获得减数分裂能力,培养24h发育到MⅡ的比例91%。完全获得减数分裂能力的1.5-5.0mm卵泡卵母细胞处于生发泡(GV)期的比率在成熟培养2-8h期间明显下降;其中,4-6h期间GⅤ比率下降最为迅速(由61%降低到19%,p<0.0005);体外培养6-12h期间MⅠ比率由25%上升到60%,随后下降,到24h仅有2%卵母细胞处于MⅠ期;培养16h有21%卵母细胞进入MⅡ期,24h 91%卵母细胞到达MⅡ期。对卵母细胞体外核成熟进程的数据做折线图计算结果表明,1.5-5.0mm卵泡卵母细胞减数分裂进程(各细胞周期事件出现和维持的时间)为:0-3.0h为GⅤ期,3.0-7.0h为前中期Ⅰ,7.0-14.6h为MⅠ期,14.6-18.4h处于后期-Ⅰ和末期-Ⅰ,18.4-24h为MⅡ期。本实验还证明,部分获得减数分裂能力(0.8-1.2mm卵泡)与完全获得减数分裂能力(1.5-5mm卵泡)的卵母细胞,其各细胞周期事件一旦发生,所需的时间是相同的。这些结果为进一步研究山羊卵母细胞减数分裂机制及其调控提供了重要的基础数据。     

小鼠卵母细胞减数分裂染色体的简易制备

正常的减数分裂是有性生殖的前提,它保证了上下代之间染色体结构和数目的稳定性。几乎所有的核型异常都来自减数分裂过程中的错误,这些错误包括同源染色体不配对、染色体不分离(首次和二次不分离)、染色体结构畸变等。卵母细胞减数分裂过程中存在着两次停滞期,其中第一次停滞期长达几个月至几年甚至几十年。在此期间卵母细胞受环境或自身病变的影响,极容易发生染色体畸变。有报道表明,卵母细胞比精母细胞在减数分裂过程中更容易发生错误。     

哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复的诱导

促使哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复的机制尚不十分清楚。有腔卵泡中发育充分的卵母细胞被减数分裂抑制因子阻滞在生发泡（GV）期,环一磷酸腺苷（cAMP)是研究得最为清楚的减数分裂抑制因子。然而,其它因子也参与了卵母细胞减数分裂的阻滞。虽然排卵前的促黄体素（LH）峰诱导卵母细胞减数分裂恢复已成定论,但是参与该事件的各种过程非常复杂,因而还没有完全确定。目前,有两种主要但并不互相排斥的假说。第一种假说认为,LH对颗粒细胞的刺激作用终止减数分裂抑制因子流向卵母细胞,从而使卵母细胞膈离这些抑制因子并进而促使减数分裂恢复,第二种假设认为LH刺激颗粒细胞产生一种减数分裂诱导信号,该信号进而克服或者破坏减数分裂抑制因子的作用。权衡这两种假说,目前的证据倾向于支持阳性信号假说,而且最近的研究暗示,该种阳性信号的产生发生在颗粒细胞中LH诱导的cAMP水平上升和MAPK激酶激活之后。     

6—DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入２ｍｍｏｌ／Ｌ６－ＤＭＡＰ可抑制卵母细胞自发的染色持浓缩和生发泡破裂（ＧＶＢＤ）。源自超排的ＭⅡ期卵母细胞则能为６－ＤＭＡＰ所激活。ｈＣＧ注射后１８－１９ｈ的卵母细胞置于２ｍｍｏｌ／Ｌ６－ＤＭＡＰ的ＣＺＢ溶液中培养０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ,卵母细胞的激活率分别为２６．１％、７５．２％、７５．８％、７７．３％、卵裂率分别为８８．２％、７３．２％、６７．０％、５８．     

蛋白水解酶复合体抑制剂lactacystin对小鼠卵母细胞减数分裂和初次卵裂的作用

为探讨泛素-蛋白水解酶复合体通路(UPP)在小鼠卵母细胞减数分裂和卵裂中的作用, 使用蛋白水解酶复合体特异性抑制剂lactacystin作用于减数分裂不同时期的卵母细胞和受精卵, 结果发现, lactacystin对GVBD的发生无明显影响, 但可明显抑制随后的减数分裂进程, 使极体排放受阻, 引起超排卵母细胞的孤雌激活率下降, 并抑制第一次卵裂. β-tubulin免疫荧光染色显示lactacystin抑制减数分裂微管的组装和纺锤体的形成; 对已进入中期的卵母细胞使用lactacystin, 则对中期纺锤体形态无影响. lactacystin还可使受精卵阻滞于间期或第一次有丝分裂中期. 免疫荧光染色还显示蛋白水解酶复合体催化亚单位PA700在GV期定位在GV及其周围区域, 在中期定位于纺锤体区域. 以上结果表明UPP对小鼠卵母细胞减数分裂和早期卵裂是必需的, 且对减数分裂的作用是多方面的, 在前期与纺锤体的正常形成有关, 而在中期则为染色体的分离和进入后期所必需.     

钙离子信号对非细胞体系中小鼠卵母细胞游离生发泡减数分裂启动的影响

本文构建了包括HeLa裂解液和游离小鼠卵母细胞生发泡的实验体系,用于研究Ca2+及其下游信号对小鼠卵母细胞减数分裂启动的影响.游离的卵母细胞生发泡可以在M期细胞裂解液中发生减数分裂启动,表现为染色质的凝集.进一步的研究表明,Ca2+信号的存在对G2期细胞裂解液促进减数分裂启动是至关重要的,G2期中期的细胞裂解液只有经Ca2+诱导后才具有启动生发泡减数分裂的作用,而G2期晚期无论Ca2+存在与否均诱发减数分裂的启动,但是G2期早期的裂解液元启动减数分裂的作用.卵母细胞的体外培养实验分析也表明,抑制CaM和CaMKII的活性可以阻止GVBD和抑制第一极体的释放.免疫沉淀及Western Blotting结果显示,HeLa细胞裂解液中的MPF从G2期中期到M期均存在,且Cdc2亚基的Tyr由磷酸化向去磷酸化转变.结果进一步证明,卵母细胞减数分裂的启动可能是通过一种Ca2+/CaM依赖的途径来推动的.     

不同活化方法对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响(简报)

随着动物克隆技术的不断发展,核移植胚胎的活化成为一个很重要的研究领域,活化的效率直接影响到克隆的成功率。小鼠体细胞克隆研究大多采用卵胞质直接注射供体细胞核的方法构建重构胚,再经SrCl_2活化处理进行体外发育。也有经电融合,SrCl_2活化产仔的报道。已有研究表明单独SrCl_2处理或电刺激均能很好地活化小鼠卵母细胞,那么在小鼠核移植过程中采用的电融合条件是否能激活卵母细胞,电脉冲刺激后再经SrCl_2处理是否能     

EGF促进小鼠卵母细胞体外减数分裂启动机制的研究

EGF和孕酮对小鼠卵母细胞减数分裂的重新启动具有促进作用,EGF的作用是通过促进颗粒细胞分泌孕酮实现的。使用孕酮合成关键酶3β-HSD的抑制剂Epostane可抑制EGF促进单层培养卵巢颗粒细胞的孕酮合成,从而降低EGF对卵母细胞的促进作用。Ca~(2 )参与了EGF和孕酮的促减数分裂重新启动作用。肝素可降低两者的作用。EGF和孕酮均可使单个卵丘颗粒细胞内的Ca~(2 )水平出现波动,并且EGF使卵丘细胞维持较高的Ca~(2 )水平。     

FSH,EGF,胰岛素促进小鼠卵母细胞体外减数分裂恢复机制的研究

FSH、EGF和胰岛素均对体外培养的小鼠卵母细胞的减数分裂的恢复起促进作用,而FSH的促进作用滞后,但作用后使卵丘细胞扩散。三者的促进作用似受卵巢颗粒细胞内游离钙和cAMP的调节。EGF和胰岛素可使培养的颗粒细胞内的cAMP水平降低;同时FSH使单个卵丘细胞内的游离Ca~(2 )水平降低,而胰岛素无影响。所以FSH、EGF和胰岛素诱发卵母细胞成熟的机制不同:EGF通过细胞内Ca~(2 )的升高和cAMP水平的下降促使卵母细胞的减数分裂恢复;FSH降低卵丘细胞内Ca~(2 )的水平,但由于卵丘细胞与卵母细胞之间的联系被打断,最终使GVBD发生;而胰岛素的作用只涉及胞内cAMP的变化。     

6-DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入2 mmol/L 6-DMAP可抑制卵母细胞自发的染色质浓缩和生发泡破裂(GVBD)。源自超排的MⅡ期卵母细胞则能为6-DMAP所激活。hCG注射后18—19h的卵母细胞置于2 mmol/L6-DMAP的CZB溶液中培养0.5 h、1h、2h、3h,卵母细胞的激活率分别为26.1%、75.2%、75.8%、77.3%、;卵裂率分别为88.2%、73.2%、67.0%、58.4%。与乙醇激活法相比,6-DMAP处理引起了不同的孤雌激活类型。     

绵羊卵泡成分对卵母细胞体外减数分裂调控的研究

哺乳动物卵巢中的卵母细胞一直处于减数分裂的停滞状态,卵泡内各成分被认为是产生抑制因子的主要来源。本研究以绵羊卵泡各成分为研究对象,用共培养的方法对卵丘细胞、颗粒细胞、膜细胞在卵母细胞体外减数分裂过程中的作用加以探讨。结果表明：1．卵泡整体及卵泡分泌物在体外可以有效地维持减数分裂停滞,经过24h培养,这两个处理组中,处于GV期的卵母细胞分别为69．6％和49．1％。经抑制处理后的卵母细胞脱离抑制环境后可以继发成熟,MⅡ比率可达88．9％。去掉卵丘细胞的裸卵其减数分裂过程不能被卵泡分泌物有效抑制,24h培养后其GV期比例为17．8％。以上结果说明卵泡中的抑制因子主要是通过卵丘细胞束发挥其调控作用的。2．用颗粒细胞与卵母细胞共培养,结果发现具有颗粒细胞卵丘细胞缝隙连接的卵母细胞(COCGs)在培养24小时后47．4％达到MⅡ,与在不具有细胞连接的总浮颗粒细胞中共培养的卵母细胞之间存在无显差异,无论是紧密连接的颗粒细胞层还是悬浮在培养液中的颗粒细胞都不能有效抑制生发泡破裂(GVBD)的发生,只能将卵母细胞抑制在MⅡ以前的各个时期。以上结果说明颗粒细胞在体外分泌抑制图子的活力大大下降。3．卵泡膜细胞具有分泌抑制成熟分裂因子的能力,与膜细胞层共培养的卵母细胞在8h和24h时,其GV期的比例为34．4％和32．7％,显高于没有膜细胞层的对照组(4．5％和1.1％)。综上所述,绵羊卵泡中的抑制因子不仅来自于颗粒细胞,而且膜细胞也参与了成熟分裂的抑制,这些细胞在体外仍具有分泌抑制因子的能力,只是与体内分泌能力有所不同。     

小鼠精子注入兔卵母细胞受精研究

利用显微操作仪将小鼠精子注入家兔卵母细胞的胞质内和透明带下,对鼠兔异种精卵互作和异种受精胚胎的发育进行了研究,并对注射精子的数量及卵的体外成熟时间等影响鼠兔异种显微受精的因素进行了探讨,结果如下:(1)将小鼠精子分别注入兔卵胞质内和透明带下,均能激活兔卵母细胞,导致精核解聚和原核形成;(2)小鼠精子注入兔卵胞质内和透明带下受精,杂种胚胎体外培养能发育到8-细胞期;(3)鼠兔异种受精4-细胞胚胎染色体标本制备观察结果表明,它们为正常二倍体;(4)鼠兔异种受精4-细胞胚胎的超微结构观察结果表明,它们极近似兔正常4-细胞胚胎的超微结构;(5)将小鼠精子注入兔卵透明带下,注射5—10个精子组卵的受精率(32.4%)和卵裂率(16.2%)均高于注射单个精子组的,但二组间差异不显著(P>0.05);DM 15%NCS液中体外成熟培养11—12h兔卵透明带下注入1—2个小鼠精子后的受精率(42.3%)和卵裂率(30.8%)均高于体外成熟培养24—25h组的,但二组间差异未达到显著水平(P>0.05)。     

应用氯化锶和放线菌酮对小鼠卵母细胞进行孤雌活化的研究

本试验研究了SrCl_2浓度和作用时间,以及卵龄和蛋白合成抑制剂放线菌酮等对昆明种小鼠卵母细胞活化的影响。研究表明,以含1.6mmol/L SrCl_2的无钙M16液对小鼠卵母细胞活化效果最好(87.0％),显著(P<0.05)优于SrCl_2浓度为1.0、5.0、10.0mmol/L的同种液体。SrCl_2作用时间10分钟显著(P<0.05)好于5、20、30或60分钟。注射hCG后18和20小时卵母细胞的活化率(分别为87.0％和84.6％)显著(P<0.01)高于14或16小时的活化率(分别为4.8％和16.5％)。CHX与SrCl_2联合使用产生显著的协同促进卵母细胞活化作用。     

卵龄和脉冲持续时间对小鼠卵母细胞电活化效果的影响

实验研究了相同电场强度，一次脉冲条件下，不同脉冲持续时间和不同卵龄对小鼠卵母细胞电活化效果的影响，结果说明：（１）在场强０．４５ＫＶ／ｃｍ，一次脉冲持续时间为１０、２０和４０μｓ时，卵母细胞活化率很低，仅为９．８％，５．５％和１２％，当脉冲持续８０、１６０、３２０、６４０和２８０μｓ时，活化率明显升高，分别为３６．５％、５３．３％，５９．７％，５１．２％和３９．４％，脉冲持续时间对卵线细胞碎裂率影     

乙醇对着床前小鼠胚胎体外发育的影响

用含不同浓度乙醇的Whitten氏培养液对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养,研究了乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含0、0．1％、0．5％、1．0％、1．5％、2．0％、3．0％、5．0％和10．0％乙醇的Whitten氏培养液对2细胞胚胎进行培养,发现小鼠2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限在1．5％左右。然后又用含1％和3％乙醇的Whitten氏培养液分别对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果发现：含1％乙醇的培养液对于8细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用,而在2细胞和4细胞胚胎中则影响不明显。3％乙醇则对各期胚胎均有不同程度的抑制作用,但随着胚胎发育其对乙醇的耐受力逐渐增强。